Koffeinintag motverkar saltkänslig hypertoni genom förbättring av natriumhantering i njurarna | vetenskapliga rapporter

Koffeinintag motverkar saltkänslig hypertoni genom förbättring av natriumhantering i njurarna | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • hypertension
  • Njure

Abstrakt

Högt saltintag är en viktig riskfaktor för hypertoni. Även om akut koffeinintag producerar måttlig diurese och natriures, ökar koffein blodtrycket (BP) genom att aktivera sympatisk aktivitet. Men de långsiktiga effekterna av koffein på urinutskillnad av natrium och blodtryck undersöks sällan. Här undersökte vi om kronisk koffeinadministration motverkar saltkänslig hypertoni genom att främja urinutsöndring av natrium. Dahl saltkänsliga (Dahl-S) råttor matades med hög saltdiet med eller utan 0, 1% koffein i dricksvatten under 15 dagar. Råttors BP, hjärtfrekvens och lokomotorisk aktivitet analyserades och urinutskillnad av natrium bestämdes. Uttrycket och funktionen av den renala epitelial Na + -kanalen (ENaC) mättes genom in vivo och in vitro- experiment. Kronisk konsumtion av koffein dämpar hypertoni inducerad av högt salt utan att påverka sympatisk nervaktivitet hos Dahl-S-råttor. Det renala a-ENaC-uttrycket och ENaC-aktiviteten hos råttor minskade efter kronisk koffeinadministration. Koffein ökade fosforylering av AMPK och minskade α-ENaC-uttryck i kortikala uppsamlingskanalceller. Inhibering av AMPK avskaffade effekten av koffein på α-ENaC. Kroniskt intag av koffein förhindrade utvecklingen av saltkänslig hypertoni genom att främja urinutsöndring av natrium, vilket var förknippat med aktivering av renal AMPK och hämning av renal tubular ENaC.

Introduktion

Högt saltintag är en viktig riskfaktor för hypertoni 1, 2 . Epidemiologiska studier visar att mer än 60% av hypertensiva individer är saltkänsliga 3 . Även om en minskning av det dagliga saltintaget 2, 0 till 2, 3 gram kan minska skadliga kardiovaskulära händelser med 20% 4, är det svårt att uppnå detta mål genom hälsoutbildning. En undersökning visade att det inte fanns någon signifikant minskning av saltintaget i USA under de senaste 20 åren 5, och att endast ett fåtal länder uppfyller den dagliga saltintagnivån på 6 g / dag som rekommenderas av WHO 5 . För närvarande används flera diuretiska och natriuretiska läkemedel ofta för att främja urinutsöndring av natrium hos hypertensiva patienter 6 . Därför är det avgörande att hitta ett mer acceptabelt tillvägagångssätt för att främja urinutsöndring i normal eller pre-hypertensiv population.

Koffein (1, 3, 7-trimetylxantin) är det mest använda psykoaktiva medlet som konsumeras dagligen av nästan 80% av världens befolkning och 90% av vuxna i Nordamerika i former av kaffe, te och mat 7, 8 . Koffein användes historiskt för att öka urinproduktionen innan dess kraftigare farmakologiska diuretika blev allmänt tillgängliga 9 . Även om akut effekt av koffein ökar blodtrycket och hjärtfrekvensen 10, 11, förhindrar kronisk koffeinadministration dietinducerad insulinresistens 12, 13, dämpar det metaboliska syndromet genom viktminskning och minskning av fettmassa 14 samt minskar fruktosinducerad hypertoni 15 .

Det är väl dokumenterat att nedsatt utsöndring av natriumnjuren spelar en kritisk roll i patogenesen av hypertoni 16, 17 . Den tiazidkänsliga NaCl-samtransportören (NCC), amiloridkänslig epitelialnatriumkanal (ENaC) och natriumväte (Na / H) -bytaren är huvudregulatorer för renal tubulär natriumreabsorption och av blodtryck 18, 19 . Bland dem förmedlar ENaC apikal inträde av natrium i den aldosteron-känsliga distala tubuli och uppsamlingskanal och står för det hastighetsbegränsande steget för natriumreabsorption i dessa nefron-segment 20 . ENaC-aktivitet stimuleras av kinaser såsom SGK1 och PKA och hämmas av PKC, ERK1 / 2 och AMPK 21 . Koffein kan aktivera AMPK i olika typer av celler, inklusive vaskulära endotelceller, skelettmuskelceller och hepatocyter 22, 23, 24 . Det är emellertid okänt om koffein reglerar ENaC-funktion i distalt nefron genom AMPK eller andra kinaser.

I den aktuella studien ansåg vi att långvarig koffeinförbrukning hämmar ENaC-funktion i distalt nefron, vilket i sin tur ökar utsöndring av natrium urin och förhindrar hypertoni inducerad av högt saltintag. För att testa denna hypotes undersöktes Dahls saltkänsliga råtta, en saltkänslig hypertoni-modell 25, 26, i denna studie. Vi tillhandahåller bevis in vivo och in vitro för att AMPK-aktivering genom koffein främjade urinutskillnad av natrium och sänkt blodtryck genom hämning av ENaC-funktionen i saltkänsliga råttor. Föreliggande resultat antyder också att de akuta och kroniska verkningarna av koffein förmedlas via olika platser i njurrören.

Resultat

Effekt av kroniskt koffeinintag på blodtrycket

Trots lägre vatten- och matintag under de första tre dagarna hade kroniskt koffeinintag ingen effekt på vatten- och matintaget i Dahl-S-råttor därefter (Fig. 1a, b), men minskade deras kroppsvikt betydligt jämfört med kontroller från den 12: e dagen av behandling (fig. 1c). På samma sätt, även om koffeinintaget temporärt ökade blodtrycket den andra dagen, dämpade långsiktigt koffeinintag hög salt-inducerad ökning av systoliskt, men inte diastoliskt blodtryck på ett tidsberoende sätt (Fig. 1d, e). 24-timmars ambulant systoliskt blodtryck den 15: e dagen var lägre i koffeinbehandlade råttor. Denna antihypertensiva effekt av kroniskt koffein var tydligare på natten när råttorna var mer aktiva (Fig. 1f). 24 timmar ambulant diastoliskt blodtryck skilde sig inte mellan de två grupperna (Fig. 1 g).

Image

( a - c ) Vatten, matintag och kroppsviktanalyser efter högt salt (kontroll) eller högt salt plus koffein (koffein) ingripande (n = 8). ( d, e ) Systoliskt blodtryck och diastoliskt blodtrycksanalyser i kontroll- eller koffeingrupper (n = 9). ( f, g ) 24 timmar systoliskt och diastoliskt blodtryck i medvetna Dahl-S-råttor den 15: e dagen av koffeinintervention (n = 9). All data presenteras som medel ± SEM. * P <0, 05 jämfört med kontroll.

Bild i full storlek

Effekt av kroniskt koffeinintag på sympatisk nervaktivitet och vaskulär funktion

På den andra dagen ökade initialt koffein hjärtfrekvensen och den rörliga aktiviteten, därefter fanns det ingen signifikant skillnad i hjärtfrekvens och rörelseaktivitet mellan kontroll och koffeinbehandlade Dahl-S-råttor (Fig. 2a, b). Följaktligen var koncentrationen av katekolamin i plasma inte olika mellan de två grupperna (Fig. 2c). Förutom sympatisk nervaktivitet påverkades inte elektrisk fältstimulering (EFS) -inducerad mesenterisk artärsträngning av koffein (Fig. 2d). På samma sätt var både endotelberoende och oberoende relaxationer av mesenteriska artärer nästan lika mellan de två grupperna (fig. 2e, f). Dessa resultat indikerar att varken sympatisk nervaktivitet eller vaskulär funktion är ansvarig för den antihypertensiva effekten av kroniskt koffeinintag.

Image

( a, b ) Lokomotorisk aktivitet och hjärtfrekvensförändringar i kontroll- och koffeingrupper (n = 5). ( c ) Plasmakatololamankoncentration den 16: e dagen (n = 6). ( d ) Elektrisk fältstimulering-inducerad mesenterisk arteriell sammandragning är liknande i kontrollgrupper och koffeingrupper. Resultaten uttrycks i procent av den initiala kontraktionen som framkallas med 60 mM KCl (n = 5). ( e, f ) Endotelberoende vasodilatation inducerad av acetylkolin (Ach) var inte signifikant annorlunda vad gäller kontroll och koffeingrupp (n = 5). Endotel-oberoende vasodilatation inducerad av nitroglycerin (NTG) var också liknande i kontrollgrupp och koffeingrupp (n = 5). Resultaten uttrycks i procent av den maximala kontraktionen som framkallas av 10 −5 M fenylefrin (PE). All data presenteras som medel ± SEM. * P <0, 05 jämfört med kontroll.

Bild i full storlek

Kroniskt intag av koffein ökar utsöndring av natrium urin

För att undersöka om kroniskt koffeinintag har en diuretisk eller natriuretisk effekt, mätte vi den 24-timmars urinvolymen och natriumkoncentrationen i urinen hos koffeinbehandlade råttor och kontrollråttor. Intressant, trots att den inte har förändrat 24-timmars urinvolym (Fig. 3a), ökade kroniskt koffeinintag urin-natriumkoncentrationen och natriumutsöndring (UNaV) (Fig. 3b, c) utan att påverka natriumkoncentrationen i plasma (Fig. 3d). Därför skulle ökning av urinutsöndring av natrium främst bidra till den anti-hypertensiva effekten av koffein.

Image

( a ) 24-timmars urinvolym var inte signifikant annorlunda efter högt salt (kontroll) eller högt salt plus koffein (koffein) ingripande (n = 5) ( b ) Kroniskt koffeinintag ökade natriumkoncentrationen i urinen ( c ) Kroniskt koffeinintag ökade 24 -harm total natriumutskillelse i urin (n = 5). ( d ) Analys av plasma-natriumkoncentration visade ingen skillnad i kontroll och koffeingrupp (n = 6). All data presenteras som medel ± SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01, jämfört med kontroll.

Bild i full storlek

Kroniskt intag av koffein hämmar renal αENaC

Vi undersökte vidare vilken renal natriumtransportör som är involverad i effekterna av koffein. Långtidsadministrering av koffein minskade a-ENaC-proteinuttrycket i kortikalt uppsamlingskanal av Dahl-S-råttor, medan mängderna av P- och y-underenhetsproteiner av ENaC var oförändrade. Proteinnivån för den tiazidkänsliga NaCl-samtransportören (NCC) i den distala tubuli var också oförändrad genom kroniskt koffeinintag (fig. 4a och kompletterande fig. 1). För att fastställa betydelsen av ENaC för effekten av koffein på urinutsöndring av natrium, fick Dahl-S-råttor en intraperitoneal injektion av amilorid (3 mg / kg), en specifik ENaC-hämmare. Den ENaC-beroende natriumreabsorptionen utvärderades genom förändring av urinutsöndring av natrium efter amiloridintervention. Kaffeinbehandlade Dahl-S-råttor hade en svagare ENaC-beroende natriumreabsorption än kontroller (Fig. 4b). Däremot var hydroklortiazid (12, 5 mg / kg) hämning av renal tubulär transport av natrium genom NCC likartad i kontroll- och koffeinbehandlade råttor (Fig. 4c). Således var natriuretisk effekt av kroniskt koffeinintag beroende av renal a-ENaC-aktivitet snarare än NCC.

Image

( a ) Western blot-analys av kortikala uppsamlingskanallysater. Kronisk intag av koffein avdöd αENaC-uttryck utan signifikant inflytande på βENaC, yENaC och natriumklorid-cotransporter (NCC) -uttryck (n = 6). ( b ) Representativa kurvor (vänster panel) visar den individuella 24-timmars UNaV för råttor i kontrollgrupp och koffeingrupp före och efter amiloridinjektion (3 mg / kg, intraperitoneal). Kolumnerna (höger panel) visar förändringarna i 24-timmars UNaV efter amiloridinjektion (n = 8). ( c ) Representativa kurvor (vänster panel) visar den individuella 24-timmars UNaV för råttor i kontrollgrupp och koffeingrupp före och efter hydroklortiazid (HCTZ) injektion (3 mg / kg, intraperitoneal). Kolumnerna (höger panel) visar förändringarna i 24-timmars UNaV efter HCTZ-injektion (n = 8). All data presenteras som medel ± SEM. * P <0, 05 jämfört med kontroll.

Bild i full storlek

Koffeinbehandling dämpar ENaC-funktionen genom att aktivera AMPK

För att undersöka den mekanism som ligger bakom koffeininducerad ökning av urinutskillnad av natrium medierad av a-ENaC-hämning, mättes uttryck av kinasproteiner i kortikala uppsamlingskanalceller (M1-CCD). Koffeinexponering under 24 timmar minskade a-ENaC-proteinuttryck utan att påverka proteinnivåerna av SGK1, ERK1 / 2 och PKCa. Ett undantag var aAMPK och dess fosforylerade form, som ökades som svar på koffein (fig. 5a och kompletterande fig. 2a). Således bestämde vi om effekten av koffein på α-ENaC-subenhetsuttrycket var beroende av AMPK. Koffin utövade dosberoende effekter för att öka αAMPK- och fosf-AMPK-proteinnivåerna i samband med reducerad α-ENaC. Dessutom avskaffade förening C, en AMPK-hämmare effekterna av koffein på aAMPK, fosf-AMPK och a-ENaC-proteinnivåer (fig. 5b och kompletterande fig. 2b). Dessutom visade elektrofysiologisk bedömning av ENaC-aktivitet i M1-CCD-celler att exponering av koffein under 24 timmar minskade den öppna sannolikheten för ENaC (fig. 5c). Dessa data indikerar att koffeinbehandling minskar proteinnivåerna i a-ENaC genom en mekanism som involverar AMPK och minskar den öppna sannolikheten för ENaC i njuruppsamlingskanalen som leder till minskad natriumreabsorption och ökad natriumutsöndring.

Image

( a ) Western blot-analys visade att inkubation med koffein (10 mM) under 24 timmar signifikant minskade αENaC-uttryck och ökade AMAMPK-uttryck utan signifikant påverkan på SGK1, ERK1 / 2 och PKCa-uttryck (n = 6). ( b ) Inkubation med koffein (Caf, 1 mM till 10 mM) dosberoende avdöd ENaC-uttryck i M1-CCD-celler, men ökade AMPK- och fosf-AMPK-uttryck i M1-CCD-celler. Förening C (C, 1 μM) avskaffade effekten av koffein på ENaC, AMPK och fosf-AMPK-uttryck. (n = 5). ( c ) Representativa EN-kanalsspår med en kanal respektive inspelade från två grupper av M1-CCD-celler med användning av saltlösning eller koffein till det basolaterala badet; nedåtgående evenemang representerar kanalöppningar; strömmarna övervakades under minst 30 minuter. (n = 8). NPo, produkten av antalet kanaler och den öppna sannolikheten användes för att mäta kanalaktiviteten i en patch. All data presenteras som medel ± SEM. * P <0, 05 jämfört med kontroll, ** P <0, 01 jämfört med kontroll.

Bild i full storlek

Diskussion

Föreliggande studie visar att kronisk koffeinadministration främjar urinutsöndring av natrium och sänker blodtrycket hos saltkänsliga hypertensiva råttor. Dessutom är denna effekt av koffein oberoende av den sympatiska nervaktiveringen och vaskulära funktionen. Den natriuretiska effekten av koffein förmedlas genom hämning av renal αENaC-funktion utan att det påverkar den tiazidkänsliga NaCl-samtransportören. I både in vitro- och in vivo- studier, koffein uppreglerad αAMPK-nivå som undertryckte αENaC-uttryck och aktivitet.

Koffein är en viktig ingrediens i ett antal av de mest konsumerade alkoholfria dryckerna 27 . Även om de diuretiska och natriuretiska effekterna av koffein har erkänts under lång tid, var den mekanism som ansvarar för koffeineffekten inte belyst helt. Thomsen et al . rapporterade att akut intag av koffein ökar litium-clearance som återspeglar natriumreabsorption i proximal tubuli 28 . Rieg et al . visade att den akuta diuresen och natriuresen som producerades av koffein var relaterad till blockad av adenosin A 1- receptorer 29 . Emellertid undersöks de kroniska effekterna av koffein på renal natriumhantering. Den diuretiska effekten av koffein är kortlivad och är lätt att utveckla tolerans 30 . Dessutom observerades ingen dehydrering hos vanliga kaffedrinkare 31 . Dessa resultat tyder på att andra mekanismer kan vara involverade när kronisk koffein används. I den aktuella studien fann vi att kroniskt koffeinintag dominerande ökade 24-timmars urinutskillnad urin men inte urinvolym hos Dahl-S-råttor jämfört med kontrollråttor. Denna natriuretiska effekt men inte urindrivande effekt antydde en primär åtgärd på natriumhantering i njurarna vid kroniskt koffeinintag.

I vår studie visade vi att urinutskillnaden av natrium ökade efter koffeinintervention utan förändring i natriumkoncentrationen i plasma. Likaså Burge et al . rapporterade att administrering av långtidsdiuretika (amilorid och hydroklortiazid) vid terapeutisk dos inte har någon inverkan på plasmadatriumkoncentrationen 32 . Eftersom koffein uppvisar en mycket svagare natriuretisk effekt än diuretika 9, skulle kronisk koffeinadministration inte påverka osmolaliteten i plasma.

Det är väl dokumenterat att tiazidkänslig NaCl-cotransporter (NCC), amiloridkänslig epitelialnatriumkanal (ENaC) och natriumväte (Na / H) -bytare är huvudreglatorer för renal tubulär natriumreabsorption och därmed påverkar blodtrycksreglering 18, 19 . Dessa epitelialatriumtransportörer kan regleras av flera kinaser, såsom proteinkinas C, utan lysinkinas (WNK) 4 och 1, ERK 1/2 och serum- och glukokortikoidinducerbart proteinkinas 1 (SGK1), liksom som AMPK 16, 21 . Störningar i signalering via dessa kinasvägar kan resultera i humant natriumretention och hypertoni 33, 34, 35, 36 . Tidigare studier på oocyter och epitelvävnader visade att AMPK hämmar natriumtransport genom att öka Nedd4-2-beroende ENaC-återvinning från membranet 37, 38 . Vissa studier rapporterade att koffein kan aktivera AMPK i olika typer av celler 22, 23, 24 . I in vivo- studien minskade kroniskt koffeinintag proteinnivåerna och funktionen hos ENaC, men inte NCC, vilket också påverkar njurelektrolyttransport och blodtryck i den distala invecklade tubuli 39 . Således verkar koffein öka urinutskillningen av natrium genom att hämma ENAC-renal aktivitet sekundär till AMPK-vägen. Huruvida koffein hämmar den öppna sannolikheten för ENaC genom att reglera dess uttryck eller förmåga behöver fortfarande undersökas.

Vi bekräftade också att akut intag av koffein inducerade en initial ökning av blodtrycket i samband med en kortvarig ökning av den lokomotoriska aktiviteten och hjärtfrekvensen hos Dahl-S-råttor, vilket troligen är förknippat med sympatisk nervaktivering. Däremot kunde dessa effekter inte observeras i långsiktigt koffeinintag. Det är viktigt att långvarig administration av koffein sänkte blodtrycket, vilket inte var förknippat med sympatisk nervaktivering och kardiovaskulära förändringar hos Dahl-S-råttor. Det antydde att kroniska hypotensiva effekter av koffein kunde orsakas av dess natriuretiska effekter i Dahl-S-råttor. Vissa studier har rapporterat att systoliskt blodtryck, snarare än diastoliskt blodtryck, påverkas av urinutskott 40, 41 . Detta kan delvis förklara varför koffein misslyckades med att förhindra hög saltsinducerad ökning av diastoliskt blodtryck i vår studie. Dessutom visade en ny studie också att ambulant systoliskt blodtryck var omvänt korrelerat med koffein i urin och dess metaboliter hos vuxna från en allmän befolkning, vilket indikerade en potentiell skyddande effekt av koffein på blodtrycket 42 . Således kan kroniskt koffeinintag vara ett effektivt livsstilsintervention för att främja utsöndring av salt hos människor som normalt konsumerar en hög saltdiet. Emellertid garanterar dess tillämpning på människa ytterligare beslutsamhet i framtiden.

Sammanfattningsvis har vi visat att kroniskt koffeinintag förhindrar saltkänslig hypertoni hos Dahl-S-råttor. Den gynnsamma effekten av koffein är förknippad med aktivering av njur AMPK som hämmar ENaC-aktivitet, vilket därefter ökar urinutsöndring av natrium och upprätthåller blodtrycket under hög saltdiet. Emellertid måste kronisk effekt av koffein på djurmodeller valideras ytterligare hos människor. Dessa fynd ger insikt i den fysiologiska rollen koffein i en långsiktig reglering av blodtrycket genom att påverka natriumhantering.

Material och metoder

Djurbehandling

Sex veckor gamla Dahl saltkänsliga råttor (Dahl-S) erhölls från Vital River Company, Peking, Kina och hölls under kontrollerad temperatur (21–23 ° C) med en ljusmörk cykel 12/12 timmar med fri tillgång till mat och vatten. Djur bedövades genom inandning av 2% isofluran (v / v) och implanterades kirurgiskt med BP-telemetriska sändare (TA11PA-C40, Data Sciences International, Minnesota, USA). Efter att ha återhämtat sig från operationen under 10 dagar tilldelades djur slumpmässigt två grupper: Kontrollgruppen gavs ett högt salt chow innehållande 8% (vikt / vikt) NaCl och normalt dricksvatten. Koffingruppen matades 8% NaCl-chow och 0, 1% koffein i deras dricksvatten. Den dietiska interventionen varade i 15 dagar. Alla försöksförfaranden utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee från Institute of Third Military Medical University, och alla experiment utfördes i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer för användning av försöksdjur.

Blodtryck och lokomotorisk aktivitetsmätning

24-timmars ambulerande blodtryck och lokomotorisk aktivitet mättes med radiotelemetri i medvetna, obegränsade råttor som tidigare beskrivits 43 . Vi samlade data i 10 sekunder var 30 minut och använde medelvärdena på 24 timmar för analysen.

Urinprovsanalys

Den 16: e dagen överfördes råttor till enskilda metaboliska burar (Tecniplast, Italien). Båda grupperna höll samma dietintervention som nämnts tidigare och hade fri tillgång till mat och vatten. 24-timmars vattenförbrukning och urinutsöndring av vatten och natrium mättes. Natriumkoncentrationer i urinen mättes med hjälp av en flamfotometer (Spectrum, Shanghai China). Utskillnad av natrium urin (UNaV) beräknades med denna formel: UNaV = [urin natriumkoncentration] × [24-timmars urinvolym].

Vaskulär reaktivitet och elektrisk fältstimulering

Kärlreaktivitet och elektriskt fältstimulering utfördes såsom beskrivits tidigare 44 . Efter att råttor bedövats med pentobarbitalnatrium (100 mg / kg kroppsvikt ip), avlägsnades den mesenteriska vaskulära bädden och placerades i en kall (4 ° C) Krebs-lösning innehållande (mM): 118 NaCl, 25 NaHC03, 11D- glukos, 4, 7 KCl, 1, 2 KH2P04, 1, 17 MgS04 och 2, 5 CaCl2. De andra grenarna av mesenteriska artärer dissekerades ut och bindvävnaden avlägsnades. Artärsegmenten (2–2, 5 mm i längd) monterades i en myograf. Kärlringar badades i Krebs-lösning luftades med 95% 02 och 5% CO2 vid 37 ° C (pH 7, 4) och sträcktes till den optimala baslinjespänningen (2, 5 mN). Ringarna ekvilibrerades i 60 minuter innan ett experiment startade. Krebs-lösning med hög K + (60 mM) tillsattes för att testa kontraktiliteten. Isometriska sammandragningar registrerades med användning av ett datoriserat datainsamlingssystem (PowerLab / 8SP; AD Instruments Pty Ltd., Castle Hill, Australien).

Elektrisk fältstimulering (EFS) uppnåddes med hjälp av en stimulator (Grass SD9) ansluten till två platinaelektroder placerade på vardera sidan av ringen parallellt med dess längdaxel. Frekvens-svarskurvorna (2–32 Hz, 30 V, 30 s tåg och 1 ms varaktighet) erhölls. Det fanns ett intervall på 1 min mellan varje stimulans för att möjliggöra återhämtning av basaltonen. För att utvärdera det neurala ursprunget för det EFS-inducerade kontraktila svaret, sattes nervimpulsutbredningsblockeraren, tetrodotoxin (TTX, 0, 1 mM) till badet 30 minuter innan den andra frekvens-svarskurvan bestämdes.

Beredning av njurcortikal uppsamlingskanal

Råttor bedövades med natrium pentobarbital (100 mg / kg kroppsvikt ip), cirkulationssystemet perfunderades via den vänstra ventrikeln med Eagles minimal essentiella medium (MEM) innehållande kollagenas (1 mg / ml), sojaböntrypsininhibitor (2 μg / ml ), aprotinin (2 μg / ml). Efter perfusion avlägsnades njurarna, skars i koronala skivor och inkuberades under 10–15 minuter vid 37 ° C i samma lösning som användes för perfusionen. Efter tvättning av kollagenas hölls skivor i iskall MEM innehållande sojaböntrypsininhibitor (2 ug / ml) under mikrosektionsproceduren. Segment av njurcortikaluppsamlingskanal (CCD) separerades manuellt med hjälp av fina pincett och identifierades med karakteristiska grenar som indikerar CCD-skivor. Poolerna av CCD-skivor innehållande 10–20 mikrodisekerade tubuli med den totala rörformiga längden ~ 10 mm / pool överfördes i 5 ul Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) / Ham's F-12 (1: 1) medium till 1, 5 ml Eppendorf rör och kyls i -70 ° C för proteinextraktion 45 .

Amilorid- och hydroklortiazidtestet

En annan grupp av råttor användes för att utvärdera effekten av koffein på ENaC och NCC-funktion vid distalt nefron. Proceduren för femton dagars dietinsatser var densamma som nämnts i avsnittet Djurbehandling. Därefter överfördes råttor till metaboliska burar. Ett urinprov dygnet runt samlades in i metaboliska burar. Därefter administrerades råttorna av amilorid (3 mg / kg, ip), en ENaC-antagonist eller hydroklortiazid (12, 5 mg / kg, ip), en NCC-antagonist. Efter administrering av amilorid eller hydroklortiazid samlades ytterligare ett urinprov dygnet runt. Natriumkoncentrationer i urinen mättes med hjälp av en flamfotometer (Spectrum, Shanghai China).

M1-CCD-cellkultur

Den renala kortikala uppsamlingskanalen M1-CCD-cellinje köptes från American Type Culture Collection (CRL-2038; American Type Culture Collection, Manassas, VA). M1-CCD-celler odlades i DMEM / F-12 (1: 1) medium med FBS (5%) kompletterat med L-glutamin (2 mM), penicillin (100 mg / ml), streptomycin (100 U / ml), och dexametason (5 mM) och odlades vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator. Roliga celler erhölls genom serumfri mediuminkubation under 12 timmar före behandling av koffein (Sigma, serienummer: 93784) och AMPK-hämmaren förening C (Calbiochem, serienummer: 171260).

Western Blotting-analys

Western blotting-analys utfördes med användning av standardförfaranden såsom tidigare beskrivits 46 . Antikropparna mot aENaC (sc-21012), pENaC (sc-21013), yENaC (sc-21014), SGK1 (sc-28338), ERK1 / 2 (sc-135960), PKCa (sc-8393), AMPKa (sc -25792) och fosfor-AMPKa (sc-33524) köptes från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). NCC-antikroppen (AB3553) var en produkt från Millipore (Merck Millipore Corporation, Darmstadt, Tyskland) och den interna kontrollen GAPDH-antikropp (KC-5G5) köptes från Kang Chen Bio-tech Incorporation, Kina. Överförda PVDF-membran inkuberades med primära antikroppar vid 4 ° C under 12 timmar. Efter inkubering med sekundära antikroppar (ZSGB-BIO, Kina) vid rumstemperatur under 2 timmar detekterades proteinerna med förbättrad kemiluminescens och kvantifierades med användning av en Gel Doc 2000 Imager (Bio-Rad, USA). Proteinnivåerna normaliserades till den interna kontrollen GAPDH.

elektro~~POS=TRUNC

För inspelningar av enkanal av ENaC studerades M1-CCD-celler under spänningsklämmor under användning av standardmetoder såsom tidigare beskrivits. En patchpipett med motståndet 6–8 MΩ tillverkades från en borosilikatglaskapillär (1, 5 mm od, 0, 86 mm id, Sutter Instrument, Tyskland) på en Sutter Puller (P97, Sutter Instrument, Tyskland). Badlösningen var (i mM): 110 NaCl, 4, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 5 Hepes, 5 Na-Hepes (pH 7, 2) med en pipettlösning av: 110 NaCl, 4, 5 KCl, 0, 1 EGTA, 5 Hepes, 5 Na-Hepes (pH 7, 2). Enkelskanaliga strömmar registrerades med en EPC-10 patch-klämförstärkare (HEKA Instrument, Tyskland) och PATCHMASTER 8.0 programvara (HEKA Instruments, Tyskland). Data inhämtades genom applicering av 0 mV pipettpotential och samplades vid 5 KHz och lågpassfiltrerades vid 1 KHz. Under post-hoc- analys filtrerades data vidare vid 50 Hz och enkelkanalshändelser listades och analyserades med klämpass 10.2-mjukvara (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Det totala antalet funktionella kanaler i en lapp bestämdes genom att observera antalet toppar detekterade på det aktuella amplitudhistogrammet under minst 10 min inspelningsperiod. NPo, produkten av antalet kanaler och den öppna sannolikheten eller den öppna sannolikheten (Po) för ENaC före och efter applicering av testmedel beräknades med användning av Clampfit 10.2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). I enkanalsposter registrerades kontrollen ENaC-aktiviteten under 3-4 minuter efter bildandet av det cellfästa läget och ENaC-aktiviteten hade stabiliserats. Vi spelade vanligtvis minst 30 minuter av någon experimentell manipulation.

Statistisk analys

Alla data uttrycks som medelvärde ± SEM. Statistiska signifikanta skillnader mellan två grupper utvärderades med hjälp av Mann-Whitney U-test. P-värden <0, 05 ansågs vara statistiskt signifikanta.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Yu, H. et al . Kaffeinintag motverkar saltkänslig hypertoni genom förbättring av natriumhantering i njurarna. Sci. Rep . 6, 25746; doi: 10.1038 / srep25746 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.