Hjärnuttrycket av gener involverade i inflammatoriskt svar, ribosomen och lärande och minne förändras av centralt injicerad lipopolysackarid i möss | journalen farmakogenomik

Hjärnuttrycket av gener involverade i inflammatoriskt svar, ribosomen och lärande och minne förändras av centralt injicerad lipopolysackarid i möss | journalen farmakogenomik

Anonim

Abstrakt

Neuroinflammation spelar en roll i utvecklingen av flera neurodegenerativa störningar. Vi använde en lipopolysackarid (LPS) -modell för neuroinflammation för att karakterisera genuttrycksförändringarna som ligger bakom de inflammatoriska och beteendeeffekterna av neuroinflammation. En enda intracerebroventrikulär injektion av LPS (5 μg) administrerades i den laterala ventrikeln av möss, och 24 timmar senare undersökte vi genuttryck i hjärnbarken och hippocampus med hjälp av mikroarray-teknik. Gene Ontology (GO) termer för inflammation och ribosomen berikades signifikant av LPS, medan GO-termer associerade med inlärning och minne hade minskat uttrycket. Vi upptäckte 224 förändrade transkript i hjärnbarken och 170 i hippocampus. Expression av Egr1 (även känd som Zif268 ) och Arc , två gener associerade med inlärning och minne, var signifikant lägre i cortex, men inte i hippocampus, hos LPS-behandlade djur. Sammantaget kan förändrat uttryck av dessa gener ligga till grund för några av de inflammatoriska och beteendeeffekterna av neuroinflammation.

Introduktion

Inflammation spelar en viktig roll i kroppens försvar mot infektion, men överaktivering av den inflammatoriska kaskaden kan ha skadliga effekter. I det centrala nervsystemet tros inflammation vara förknippat med normalt åldrande 1 och att bidra till utvecklingen av ett antal patologiska tillstånd, inklusive Alzheimers sjukdom, 2 Parkinsons sjukdom 3 och amyotrofisk lateral skleros. 4

Lipopolysaccharide (LPS) är en komponent i det yttre membranet av gramnegativa bakterier och används vanligen för att inducera inflammation i periferin och i centrala nervsystemet. Det stimulerar det medfödda immunsystemet genom interaktioner med CD14 och Toll-liknande receptor 4 (TLR4), 5, 6 som uttrycks av mikroglia, de primära immunkompetenta cellerna i hjärnan. Vid exponering för LPS aktiveras mikroglier och börjar producera proinflammatoriska mediatorer såsom cytokiner, kemokiner, prostanoider och reaktiva syrearter. 7

Även om LPS inte är direkt toxiskt för mogna neuroner, som inte uttrycker TLR4, kan 8 neuroner indirekt skadas av LPS-aktiverade mikroglia. Ett antal studier in vitro har visat att exponering av primära neuron / glia-blandade kulturer för LPS leder till neuronal död, medan ingen signifikant cellförlust observeras i neuronanrikade kulturer. 9, 10 Akut administrering av LPS direkt till hjärnan rekapitulerar dessa resultat och leder till neurondöd i hippocampus. 11 Dessutom har beteendestudier visat att objektigenkänning 12 och rumsligt minne 13 båda är nedsatt hos djur behandlade med enstaka doser av LPS. I linje med dessa kognitiva underskott är långvarig potentiering (LTP) till stor del blockerad efter akuta LPS-injektioner. 12, 14

I ett försök att karakterisera de transkriptionella förändringarna som ligger till grund för dessa fysiologiska och beteendemässiga effekter undersökte vi förändringar i genuttryck i musens hippocampus och hjärnbarken 24 timmar efter en enda intracerebroventrikulär (icv) injektion av LPS med hjälp av mikroarray-teknik.

Resultat

Vi började vår analys genom att filtrera data för att endast inkludera sonder med en pålitlig signal. Totalt 9557 kommenterade gener, RIKEN-sekvenser och uttryckta sekvensmärken passerade filtreringssteget. Därefter normaliserades råintensitetsvärdena från detta datasätt med en Z- transformation. 15 Den ursprungliga datafilen och de filtrerade, normaliserade resultaten är tillgängliga online i Gene Expression Omnibus (GEO Accession GSE12284). Med hjälp av de beräknade Z- poängen genomförde vi en huvudkomponentanalys för att minska dataens dimensionalitet och för att möjliggöra visualisering av förhållandena mellan genuttrycksprofiler, som visas i figur 1a. Den första huvudkomponenten (PC1) separerade proverna efter hjärnregion, och den andra (PC2) gjorde det på grundval av behandling. De första och andra huvudkomponenterna stod för 53, 2 respektive 16, 1% av den totala variansen, vilket indikerar att hjärnregion och behandling är ansvarig för huvuddelen av skillnaderna i genuttryck mellan proverna. För att kvantifiera uttrycksförändringarna för varje sond jämförde vi Z- poäng mellan fordonets och LPS-behandlingsgrupperna med hjälp av Z -ratio-statistiken. 15 Positiva Z -ratioer indikerar ökat uttryck relativt kontroll, och negativa Z- rötter indikerar reducerat uttryck. En plot som jämför hippocampus och cortex Z -ratios avslöjade en signifikant korrelation mellan förändringarna i varje hjärnregion ( r 2 = 0, 42, P <0, 0001; figur 1b).

Globala genuttrycksmönster. ( a ) Analys av huvudkomponenten separerar de enskilda proverna i fyra distinkta grupper med användning av varje provs genuttrycksprofil. Hippocampus och cortex visar unika mönster för genuttryck vid baslinjen (vehikel) och som svar på lipopolysackarid (LPS). Den första huvudkomponenten (PC1) separerar prover efter hjärnregion, och den andra (PC2) gör det på grundval av behandling. Varje punkt representerar ett oberoende vävnadsprov; åtta djur (LPS, n = 4; vehikel, n = 4) representeras av två punkter vardera, en för cortex och en för hippocampus. ( b ) LPS-injektion orsakar liknande transkriptionella förändringar i båda hjärnregionerna. Förändringarna i uttrycket för alla 9557-transkript som passerade filtreringssteget ritas som Z -ratios för både hippocampus och cerebral cortex. Det finns en signifikant korrelation mellan regioner ( r2 = 0, 411, P <0, 0001).

Bild i full storlek

För att tillhandahålla en funktionell tolkning av dessa effekter genomförde vi en genuppsättningsanalys med parametrisk analys av genuppsättning (PAGE) -algoritm med Gene Ontology (GO) -termer och kuraterade molekylära signaturdatabas (MSigDB) -genuppsättningar. 16, 17, 18 GO-termer är genlistor kategoriserade efter cellulär lokalisering, funktionella roller och biologiska processer 16 som inte nödvändigtvis är samreglerade. Däremot är kuraterade MSigDB-genuppsättningar listor över gener som har visat sig vara påverkade vid mänskliga sjukdomar eller av olika experimentella tillstånd. 17 Våra resultat avslöjade att ett antal proinflammatoriska genuppsättningar anrikades i båda regionerna efter LPS-administration (tabell 1). Andra genuppsättningar med ökat uttryck inkluderade GO-termer för ribosomala proteiner och aktin-cytoskeletalt omorganisation, samt en MSigDB-uppsättning som tidigare visat sig öka i den åldriga musens neocortex. 19 Ett antal GO-termer associerade med nervsystemfunktionen visade signifikant minskat uttryck hos djur behandlade med LPS. Dessutom fann vi att LPS orsakade nedreglering av en uppsättning gener som har visat sig ha minskat uttrycket i hippocampus hos patienter med Alzheimers sjukdom. 20

Full storlek bord

Vi försökte sedan identifiera enskilda gener som påverkades av LPS. Med hjälp av strikta kriterier, inklusive ett Z -ratio-avbrott på ± 1, 5 och ett P- värde <0, 05, upptäckte vi signifikanta förändringar för 170 och 224 transkript i hippocampus respektive cerebral cortex (tabellerna 2 och 3). De kompletta listorna med drabbade gener är tillgängliga som kompletterande data (kompletterande tabeller S1 och S2). Sextiofyra ändrades signifikant i båda hjärnregionerna, och alla dessa ändrades i samma riktning på mikrosystemet.

Full storlek bord

Full storlek bord

Ett antal av dessa individuellt signifikanta gener rekapitulerar resultaten av vår genuppsättning analys; gener som kodar ribosomala proteiner, proteiner med akut fas och proteiner med stressrespons visade signifikant ökat uttryck, medan de som är associerade med nervsystemets funktion, och särskilt neurotransmission, inlärning och minne, visade signifikant minskat uttryck i båda hjärnregionerna. Av särskilt intresse är generna för aktivitetsreglerat cytoskeletaltassocierat protein ( Arc ) och tidig tillväxtrespons 1 ( Egr1 , även känd som Zif268 ), som är intimt involverade i inlärning och minne. 21, 22 Microarray-data indikerade att Arc- uttryck minskades signifikant i både hippocampus ( Z -ratio = −1.84) och hjärnbarken ( Z -ratio = −5.92), medan Egr1 endast påverkades i cortex ( Z -ratio = -5, 27).

Vi validerade sedan våra mikroarray-resultat med realtids-PCR med användning av primrar och sonder för en delmängd av generna som visade sig vara individuellt signifikanta. Dessa gener valdes utifrån deras biologiska relevans och för deras brett spektrum av positiva och negativa Z- rötter. Uttrycksförändringarna för 77% av de utvalda generna från cortex bekräftades genom PCR-resultat och 54% var reproducerbara i hippocampus (tabell 4). En kurva av vikförändring bedömd med PCR kontra mikroarray Z -ratio avslöjade ett starkt linjärt förhållande för båda hjärnregionerna (figurerna 2a och b). En gen, Cxcl12 , visades emellertid genom PCR att öka med 34% i hippocampus trots att den hade en negativ Z -ratio ( Z -ratio = −3, 54). PCR visade en signifikant reduktion i Arc mRNA efter LPS i cortex, men det fanns ingen statistiskt signifikant skillnad i hippocampus (figurerna 3a och b). På liknande sätt reducerades Egr1- uttrycket signifikant i cortex, men inte i hippocampus (figurerna 3c och d).

Full storlek bord

Kvantitativ realtids PCR-validering av mikroarray-data. ( a, b ) Genuttryckförändringar uppmätta med PCR i realtid korrelerar starkt med förändringar som har hittats genom mikroarrayanalys i både cerebral cortex ( r2 = 0, 949, P <0, 0001) och hippocampus ( r 2 = 0, 95, P <0, 0001). Eftersom Z -ratio-statistiken innehåller log-normaliserade Z- poäng måste logaritmen för vikningsändringen som bedöms av PCR användas för att beräkna den linjära regressionen. Den starka korrelationen mellan PCR-resultat och mikroarray-data indikerar att uttrycksförändringarna som observerats med hjälp av mikroarrayen är verkliga och reproducerbara med mer känsliga metoder.

Bild i full storlek

Uttrycksförändringar för Arc och Egr1, bestämda med kvantitativ PCR i realtid. ( a - d ) PCR i realtid bekräftade signifikant nedreglering av Arc- och Egrl- transkript i hjärnbarken hos lipopolysackarid (LPS) -behandlade möss ( n = 8) jämfört med fordonskontroll ( n = 7), men ingen signifikant förändring var finns i hippocampus. * P <0, 05, ** P <0, 01.

Bild i full storlek

Diskussion

Målet med denna studie var att karakterisera förändringarna i genuttryck som förekommer i musens hippocampus och hjärnbarken som svar på direkt aktivering av medfödd immunitet med centralt injicerat LPS. Även om tidigare studier har beskrivit effekterna av perifer LPS-administration på hela musens hjärntranskriptom, har 23, 24 och en beskrivit genuttrycksförändringarna som inträffar i hippocampus efter en central injektion av LPS, 25 vår är den första att jämföra genen uttrycksprofiler för dessa två hjärnregioner under akut neuroinflammation. Våra resultat avslöjar att även om de två hjärnregionerna har unika genuttrycksprofiler vid baslinjen, är uttrycksförändringarna inducerade av LPS likartade i både hippocampus och cerebral cortex. Denna upptäckt antyder att båda regionerna totalt sett svarar på akut neuroinflammation.

En funktionell tolkning av dessa svar tillhandahölls genom att kartlägga effekterna av LPS på fördefinierade uppsättningar av gener från GO-projektet och MSigDB. 16, 17 Flera GO-termer förknippade med inflammation, inklusive inflammatorisk respons, kemokinaktivitet, cytokinaktivitet, neutrofil kemotaxis och leukocytkemotaxi, var mycket uppreglerade i både hippocampus och cortex efter LPS-behandling. I båda regionerna upptäckte vi också betydande anrikning av en uppsättning gener som tidigare visade sig ha ökat uttryck i den åldriga musens neocortex, 19 ytterligare stödjer konceptet att hjärninflammation ökar under normalt åldrande. 1 Sammantaget var resultaten från genuppsättningsanalysen i hippocampus och cortex påfallande lika och tyder på ett markant inflammatoriskt svar.

Expression av mRNA som kodar ribosomala proteiner ökades också i båda regionerna på nivån av genuppsättningar och individuella gener, vilket antyder att hjärnan arbetar för att öka sin kapacitet för proteinsyntes. Till stöd för denna observation rapporterade en tidigare studie på råttor att kronisk infusion av LPS orsakade ultrastrukturella förändringar i neuroner i överensstämmelse med nedsatt cytosolisk proteinsyntes. Författarna noterade också djupa invaginationer i kärnmembran som var fyllda med polyribosomer, som de tolkade som ett försök av neuroner att kompensera för nedsatt cytosolisk översättning. 26 Den ökade transkriptionen av ribosomala proteiner som vi observerade skulle stödja denna slutsats. Eftersom aktiverade mikroglia är kända för att innehålla endoplasmatisk retikulum rik på ribosomer, 26, 27 är det dock möjligt att ökningen vi hittade åtminstone delvis beror på transkriptionella förändringar som inträffar i mikroglia när de aktiveras. Ytterligare arbete kommer att krävas för att bestämma individuella bidrag från neuroner och glia till denna effekt.

GO-termerna lärande och / eller minne, synaptisk transmission och neuronmigration minskade i både hippocampus och hjärnbarken, vilket antyder att neural dysfunktion uppstår i båda regionerna som en följd av akut neuroinflammation. Faktum är att LPS-inducerad neuroinflammation har visat sig påverka neurogenes, neuritutväxt och LTP. 12, 28, 29, 30 Detta är viktiga processer i det vuxna nervsystemet, och deras störningar bidrar troligen till den försämrade kognitiva prestanda hos gnagare behandlade med LPS.

Efrinreceptorn B1 ( EphB1 ) är involverad i differentieringen och migrationen av neurala prekursorer i vuxna hippocampus och i morfogenesen av neuriter och dendritiska ryggar. 31, 32 Vi observerade signifikant minskad expression av detta transkript i båda hjärnregionerna (hjärnbark: Z -ratio = −2.45, PCR-vikningsförändring = −1.31; hippocampus: Z -ratio = −2.53, PCR-vikningsförändring = −1.41), och detta kan bidra till den nedsatta neurogenesen och till det minskade antalet dendritiska ryggar som observerats under neuroinflammation. 28, 30, 33

Trots de övergripande likheterna i transkriptionella förändringar i hippocampus och hjärnbarken, konstaterades de plastiseringsassocierade omedelbar-tidiga generna, Arc och Egr1 , endast minskas i hjärnbarken vid PCR-validering. Det har visat sig att bågprotein reglerar aktinpolymerisation och AMPA-receptorhandel vid synapser, och Egr1 är en transkriptionsfaktor som reglerar uttrycket av ett antal plasticitetsassocierade målgener, inklusive Arc . 21, 34, 35, 36, 37 Båda generna transkriberas snabbt postsynaptiskt efter stimuli som producerar beteendemässigt inlärning eller LTP, och transgena djur som saknar endera genen uppvisar nedsatt minne och försvagad LTP. 21, 22, 38, 39, 40 Med tanke på vikten av Arc och Egr1 i minnet är det troligt att deras reducerade uttryck ligger till grund för minnesunderskotten som observerats vid neuroinflammation. Till stöd för detta koncept har en antisens-medierad knockdown av Arc-proteintransaktion visat sig försämra upprätthållandet av LTP, men inte påverka dess induktion. 41 Hennigan et al. 12 erhöll liknande resultat med användning av en akut perifer injektion av LPS för att inducera neuroinflammation; författarna observerade en signifikant försämring av LTP-underhåll, men ingen förändring i LTP-induktion. I båda studierna var underskotten i LTP uppenbara inom 1 timme efter induktion. Minskat Egr1- uttryck kan också bidra till inflammationsinducerad minnesnedsättning; både LPS-behandlade råttor och Egr1 - / - möss presterar på liknande sätt vid test av objektigenkänning och misslyckas med att visa preferens för nya objekt 24 timmar efter träning. 12, 38 Dessa slående likheter tyder på att försämrat Arc- och Egr1- uttryck kan bidra till minnesproblem som uppstår som en följd av neuroinflammation. Emellertid kan genast-tidiga gener såsom Arc och Egr1 tjäna som markörer för neural aktivitet, 21, 40, 42 så det är också troligt att reduktionen vi observerade är en följd av minskad nervaktivitet i hjärnbarken. En studie av Vereker et al. 14 med samma paradigm som Hennigan men med två gånger LPS-dosen, kännetecknade signifikanta underskott i både induktion och underhåll av LTP, vilket de hänförde till sänkt frisättning av glutamat. Dessa resultat pekar på minskad excitatorisk neurotransmission, vilket också skulle ge de minskningar av Arc och Egr1- transkription som vi observerade. Eftersom dessa modeller av neuroinflammation använde perifera injektioner av LPS i råttor och vi använde centralt injicerade LPS i möss, är det svårt att direkt jämföra doseringsregimer; ytterligare studier kommer att krävas för att avgöra om glutamatfrisättning påverkas också i vår modell. En möjlig effekt av det anestetikum som användes innan dödandet av djuren bör också övervägas, eftersom generell anestesi har visat sig ha störningar i uttrycket av neuronala omedelbar-tidiga gener. 43, 44, 45, 46 Ytterligare arbete bör utföras för att hantera denna möjlighet.

Rosi et al. 47 kopplade tidigare kronisk inflammation till ökat Arc- uttryck i rygghippocampus från råttor efter kronisk infektion av icv av låga doser av LPS. Även om den kombinerade in situ- hybridiseringen och cellräkningstekniken som användes i deras studie skiljer sig märkbart från den mikromatiska och realtids-PCR-metoden som vi använde, antyder kontrasten mellan deras resultat och vår att akut och kronisk neuroinflammation kan ha divergerande effekter på Arc , och eventuellt Egr1 , transkription. Expression av dessa två gener har visat sig sänkas i samband med ß-amyloida plack hos AD-patienter, djurmodeller av AD och åldrade möss. 48, 49 Våra resultat indikerar att den inflammatoriska komponenten i Alzheimers och normalt åldrande kan vara ansvarig för denna effekt. I linje med denna hypotese återställer behandling med det icke-steroida antiinflammatoriska läkemedlet indometacin minnesprestanda och LTP i djurmodeller av AD. 50 Det är emellertid inte känt om antiinflammatorisk behandling också återställer Arc- och Egr1- uttrycket till normala nivåer. Framtida studier bör undersöka denna möjlighet.

Resultaten från denna studie indikerar att genuttrycksprofilerna i hippocampus och hjärnbarken i stort sett påverkas på liknande sätt av akut neuroinflammation. Trots den övergripande likheten mellan de två hjärnregionerna observerade vi dock minskad transkription av plastiseringsassocierade gener i hjärnbarken, men inte hippocampus. Genuttrycksförändringarna som vi har karakteriserat bidrar till förståelsen av hjärninflammation och kan hjälpa till att utveckla nya terapier för sjukdomar med en neuroinflammatorisk komponent.

Material och metoder

Djur och vävnadsbehandling

Alla djurförfaranden genomfördes enligt ett NICHD-godkänt djurprotokoll i enlighet med NIH-riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur. Möss (12 till 15 veckor gamla) uppfödda på en C57BL / 6 och SV129 / Ola genetisk bakgrund bedövades med intraperitoneal (ip) ketamin (100 mg kg −1 ) och xylazin (10 mg kg −1 ) och placerades på en stereotaktiskt bord (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA). Med hjälp av en 33-gauge nål (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) fäst vid en mikrosprutpump (Stoelting, Wood Dale, IL, USA), sterilt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) fordon (5 ul) eller LPS ( E coli- serotyp 127: B8; 5 μg i 5 ul steril PBS) injicerades i laterala ventrikeln (-2, 3 mm dorsal / ventral, -1, 0 mm i sidled och −0, 5 mm anterior / posterior från bregma) med en hastighet av 1, 0 μl min −1, som tidigare beskrivits. 11, 33, 51 24 timmar efter operationen dödades djur med en överdos av natrium pentobarbital (100 mg kg −1, ip) och halshuggades omedelbart. Även om andra studier har visat en topp i inflammatoriska markörer såsom interleukin-1β eller iNOS vid 6 timmar efter systemisk LPS-injektion, gav 52, 53 den dos av LPS som användes i vår studie, när den injicerades intracerebroventrikulärt, en topp i de flesta inflammatoriska markörer undersökta vid 24 timmar i en preliminär tidskurs pilotstudie. Denna tidpunkt har visats av oss och andra att producera betydande nivåer av neuroinflammatoriska och oxidativa stressmarkörer mätt vid 24 timmar efter icv-injektion av LPS. 11, 51, 55, 56 Hippocampus och hjärnbarken från båda halvkärlen dissekerades snabbt, snabbfryst i 2-metylbutan vid -60 ° C och lagrades vid -80 ° C. Totalt RNA extraherades från hippocampus- och cortexprover med användning av Qiagen RNeasy Lipid Tissue Mini respektive Midi-kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). RNA-kvaliteten bedömdes genom att mäta förhållandet A 260/280 . RNA-integritet verifierades genom visualisering av 28S och 18S ribosomala rRNA-band, utan närvaro av smet, med användning av en denaturerande agarosgel.

microarray

Fyra prover från varje hjärnregion och behandlingsgrupp användes. En alikvot på 0, 5 μg av totalt RNA från varje prov märktes med användning av Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, Austin, TX, USA). RNA omvandlades först till enkelsträngat cDNA med omvänd transkription med en oligo-dT-primer innehållande T7-RNA-polymeraspromotorn, och sedan kopierades det enkelsträngade cDNA för att producera dubbelsträngade cDNA-molekyler. Det dubbelsträngade cDNA användes i en transkriptionsreaktion över natten in vitro där enkelsträngat RNA (cRNA) genererades och märktes genom införlivande av biotin-16-UTP. Totalt 0, 75 μg biotinmärkt cRNA hybridiserades under 16 timmar till Illuminas Sentrix MouseRef-8 Expression BeadChips (Illumina, San Diego, CA, USA). Varje BeadChip har 24 000 välantecknade RefSeq-transkript per prov med ungefär 30-faldig redundans. Matriserna tvättades och blockerades. Biotinylerat cRNA detekterades med streptavidin-Cy3 och kvantifierades med hjälp av Illuminas BeadStation × 500 Genetic Analys Systems-skanner. Bilddata extraherades med BeadStudio-programvara (Illumina).

Dataanalys

Uttrycksdata filtrerades för att inkludera endast sonder med en konsekvent signal på varje chip; avskärningsvärdet fastställdes vid P <0, 02. Det resulterande datasättet analyserades sedan med DIANE 6.0, ett kalkylbladbaserat mikroarrayanalysprogram. En översikt över DIANE kan hittas online på //www.grc.nia.nih.gov/branches/rrb/dna/diane_software.pdf. Med användning av DIANE subtraherades bakgrunden från den råa signalintensiteten för varje gen, och resultaten normaliserades med en Z- sekundär transformation. 15 Z- normaliserade data analyserades sedan med huvudkomponentanalys. För att bestämma förändringar av genuttryck orsakade av LPS jämfördes Z- poäng för vehikel- och LPS-behandlingsgrupperna med Z -ratio-statistik: 15

Genuppsättningsanalys utfördes med användning av PAGE-algoritmen 18 för att detektera GO-termer 16 och kuraterade MSigDB-genuppsättningar 17 påverkade av LPS. Endast MSigDB-genuppsättningar med mer än 30% representation i det filtrerade datasättet inkluderades i vår analys. Expressionförändringar för enskilda gener ansågs betydande om de uppfyllde fyra kriterier: Z -ratio över 1, 5 eller under −1, 5; falsk detekteringsgrad 57 på mindre än 0, 30; en P- värderingsstatistik för Z- poängreplicabilitet under 0, 05; och medelbakgrundskorrigerad signalintensitet större än noll.

Kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion

Microarray-resultat validerades med kvantitativ PCR i realtid, såsom tidigare beskrivits. 51, 58 Förutom de prover som använts för mikrosystemet, tillsatte vi 3 och 4 möss för fordonet (total n = 7) respektive LPS-behandlingsgrupp (total n = 8). Följande TaqMan-genuttrycksanalyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) användes: Adcy8 (Mm00507722_m1), Apod (Mm00431817_m1), Arc (Mm00479619_g1), Ccl12 (Mm01617100_m1), Cxcl12 (Mm4) Ephb1 (Mm00557961_m1), Gabra1 (Mm00439040_m1), Gpx1 (Mm00656767_g1), Grm5 (Mm00690332_m1), Mtap1b (Mm00485261_m1), Neurod2 (Mm0044046mk1m00) Pgk1 (Mm00435617_m1) visades inte förändras genom att jämföra tröskelcykelvärden (CT) för både vehikel- och LPS-behandlingsgrupper och användes därför som en endogen kontroll. Statistisk analys utfördes genom att beräkna skillnaden i tröskelcykel (ΔCT) mellan en given målgen och Pgkl, och sedan genom att jämföra ΔCT-värden mellan vehikel ( n = 7) och LPS ( n = 8) behandlingsgrupper med Studentens t- test. Det relativa uttrycket av målgener beräknades med hjälp av Ct-metoden. 59

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • GSE12284

Kompletterande information

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabell S1

  2. 2.

    Kompletterande tabell S2

    Dualitet av intresse

    Ingen förklarade.

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen The Pharmacogenomics Journal (//www.nature.com/tpj)