Blonanserin förbättrar fencyclidininducerade minnesunderskott av visuellt igenkänning: den komplexa mekanismen för blonanserinverkan som involverar d3-5-ht2a och d1-nmda-receptorer i mpfc | Neuropsychopharmacology

Blonanserin förbättrar fencyclidininducerade minnesunderskott av visuellt igenkänning: den komplexa mekanismen för blonanserinverkan som involverar d3-5-ht2a och d1-nmda-receptorer i mpfc | Neuropsychopharmacology

Anonim

ämnen

  • Lärande och minne
  • Handlingsmekanism
  • Schizofreni

Abstrakt

Blonanserin skiljer sig från för närvarande använda serotonin 5-HT2A / dopamin-D2-receptorantagonister genom att det uppvisar högre affinitet för dopamin-D 2 /3- receptorer än för serotonin 5-HT2A-receptorer. Vi undersökte involveringen av dopamin-D 3- receptorer i effekterna av blonanserin på kognitiv nedsättning i en djurmodell av schizofreni. Vi försökte också belysa den molekylära mekanismen som ligger till grund för detta engagemang. Blonanserin, såväl som olanzapin, signifikant förbättrad fencyclidin (PCP) -inducerad försämring av visuellt igenkänningsminne, vilket demonstreras av det nya objektigenkänningstestet (NORT) och ökade extracellulära dopaminnivåer i det mediala prefrontala cortex (mPFC). Med blonanserin antagoniserades båda dessa effekter av DOI (en serotonin 5-HT 2A- receptoragonist) och 7-OH-DPAT (en dopamin-D3-receptoragonist), medan effekterna av olanzapin antagoniserades av DOI men inte av 7 -OH-DPAT. Den lindrande effekten antagoniserades också av SCH23390 (en dopamin-Dl-receptorantagonist) och H-89 (en proteinkinas A (PKA) -inhibitor). Blonanserin avhjälpte signifikant minskningen i fosforyleringsnivåer av PKA vid Thr 197 och NR1 (en väsentlig underenhet av N- metyl-D-aspartat (NMDA) receptorer) vid Ser 897 av PKA i mPFC efter en NORT-träningssession i PCP- administrerade möss. Det fanns inga skillnader i nivåerna av NR1 fosforylerad vid Ser 896 av PKC i någon grupp. Dessa resultat antyder att den förbättrade effekten av blonanserin på PCP-inducerad kognitiv försämring är associerad med indirekt funktionell stimulering av dopamin-D1-PKA-NMDA-receptorvägen efter förstärkning av dopaminerg neurotransmission på grund av hämning av både dopamin-D3 och serotonin 5 -HT 2A- receptorer i mPFC.

INTRODUKTION

Schizofreni kännetecknas av kognitiva försämringar samt positiva och negativa symtom (Freedman, 2003). Kognitiva funktionsnedsättningar är mer genomgripande än positiva och negativa symtom och fluktuerar mindre över tid, och de är starkt förknippade med dålig psykosocial funktion (Spaulding et al, 1994). Nedsättningarna tros orsakas av dopaminerga och / eller glutamatergiska hypofunktioner som leder till hypostimulering av dopamin-D1-receptorer respektive / eller N- metyl-D-aspartat (NMDA) -receptorer i den dorsolaterala prefrontala cortex (dlPFC) hos patienter med schizofreni (Javitt, 2007). DlPFC hos människor motsvarar medial PFC (mPFC) för gnagare (Brown och Bowman, 2002).

Blonanserin har en bindningsprofil som är unik bland de atypiska antipsykotiska läkemedlen (APD) genom att det uppvisar en högre affinitet för dopamin-D 2 /3- receptorer än för serotonin 5-HT2A-receptorer. I själva verket har föreningen betecknats en dopamin-serotonin-antagonist (DSA) (Tenjin et al, 2013). Kliniskt uppvisar blonanserin atypiska APD-egenskaper, med effekt mot positiva och negativa symtom och kognitiva försämringar (Tenjin et al, 2013). Det är också generellt väl tolererat och verkar ha en acceptabel profil när det gäller kroppsviktökning. Läkemedlets potentiella tolerabilitetsfördelar i kortvariga studier med schizofrenipatienter inkluderade färre extrapyramidala symtom (EPS) än med haloperidol (Garcia et al, 2009) och färre rapporter om prolaktinnivåökningar (hyperprolaktinemi) än med risperidon (Takahashi et al, 2013). I djurstudier har blonanserin visat aktivitet för att minska flera psykobeteende abnormiteter hos möss administrerade phencyclidin (PCP), en icke-konkurrenskraftig NMDA-receptorantagonist som inducerar schizofreniliknande psykotomimetiska tillstånd hos människor och gnagare (Castner et al, 2004; Javitt och Zukin, 1991; Morris et al, 2005; Noda et al, 2001; Noda et al, 1995). PCP-inducerad hyperlocomotion, som anses vara en modell av de positiva symptomen på schizofreni, antagoniserades signifikant av blonanserin. Potentiering av tvingad simning-inducerad immobilitet genom PCP, en djurmodell av schizofreniska negativa symtom, antagoniserades också av blonanserin såväl som av andra atypiska APD: er (Nagai et al, 2003). Nyligen har blonanserin visat att vända den PCP-inducerade kognitiva försämringen i NORT på grund av indirekt serotonin 5-HT 1A- receptoragonism hos råttor (Horiguchi och Meltzer, 2013).

De prekliniska bevisen tyder på att dopamin-D3-receptorer påverkar kognition genom att modulera mPFC-funktionerna trots de relativt få dopamin-D3-receptorerna i denna region (Nakajima et al, 2013). Till skillnad från andra atypiska APD: er har blonanserin en hög affinitet för dopamin-D 3- receptorer (Tenjin et al, 2013) och förbättrar den kognitiva funktionen i schizofreni (Tenjin et al, 2012). Emellertid förblir mekanismen för att förbättra effekten av blonanserin på kognitiv nedsättning trots grundläggande studier och kliniska studier.

Syftet med denna studie var att undersöka effekten av blonanserin på försämringen av visuellt igenkänningsminne inducerat i möss genom upprepad PCP-administration och att ytterligare belysa involveringen av dopamin-D3 och / eller serotonin 5-HT 2A- receptorer i denna modell . Studien utformades också för att analysera de postsynaptiska mekanismerna som låg bakom effekten av blonanserin på försämring av visuellt igenkänningsminne. Vi fann att blonanserin indirekt aktiverar dopamin- och NMDA-receptorer efter förstärkning av dopaminerg neurotransmission i mPFC.

MATERIAL OCH METODER

djur

Hanmöss av ICR-stammen (Japan SLC, Shizuoka, Japan), i åldern 6 veckor i början av experimenten, användes. Djuren hölls i plastburar som hölls i en reglerad miljö (22 ± 2 ° C, 55 ± 10% fuktighet) med en 12: 12 timmars ljus: mörk cykel (tändes vid 0800 timmar). Mat (CE2; CLEA Japan, Tokyo, Japan) och kranvatten var tillgängliga ad libitum .

Beteendexperiment utfördes i ett ljuddämpat och luftreglerat rum, till vilket möss var vana i minst 1 timme. Alla experiment genomfördes blinda för behandling och i enlighet med Meijo Universitys fakultet för farmaceutiska riktlinjer för djurförsök. Förfarandena som involverar djur och deras vård överensstämde med de internationella riktlinjerna som anges i principerna för laboratoriedjuromsorg (publikationen National Institute of Health nr 85–23, reviderad 1985).

Narkotika

Blonanserin levererades av Dainippon Sumitomo Pharma (Osaka, Japan). Olanzapine (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada), DOI (R (-) - 2, 5-dimetoxi-4-jodampetaminhydroklorid; RBI-Funakoshi, Tokyo, Japan), 7-OH-DPAT ((±) -7- hydroxi-N, N-di-n-propyl-2-aminotetralinhydrobromid; RBI-Funakoshi), SCH23390 (R (+) - 7-kloro-8-hydroxi-3-metyl-1-fenyl-2, 3, 4, 5-tetrahydro-lH-3-bensazepinhydroklorid; (RBI-Funakoshi) och H-89 (N- [2- (p-bromocinnamylamino) etyl] -5-isokinolinesulfonamid; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) PCP syntetiserades av författarna enligt metoden beskriven av Maddox et al (1965) och kontrollerades med avseende på renhet.

Blonanserin och olanzapin löstes initialt i en minsta mängd av 1, 0 N HCl och späddes med saltlösning. DOI, 7-OH-DPAT, SCH23390, H-89 och PCP löstes i saltlösning.

Drug Behandlingar

Mössen fick salt eller PCP (10 mg / kg / dag, sc) en gång om dagen under 14 dagar i rad (Noda et al, 1995). Det nya objektigenkänningstestet (NORT) och mikrodialysexperimentet startades 1 dag respektive 3 dagar efter avlägsnande av PCP-administrering. De salt- eller PCP-administrerade mössen behandlades med blonanserin (1 eller 3 mg / kg, po) eller olanzapin (1 eller 3 mg / kg, po) med användning av en engångsfodernål 30 minuter före NORT-träningssessionen eller omedelbart efter baslinjen samling i mikrodialysexperimentet. DOI (3 mg / kg, ip) injicerades 25 minuter efter behandling med blonanserin eller olanzapin. 7-OH-DPAT (0, 05 mg / kg, ip) och SCH23390 (0, 02 mg / kg, sc) injicerades 30 minuter före behandling med blonanserin eller olanzapin. H-89 (0, 03 eller 0, 1 nmol / ul) administrerades bilateralt i det mediala prefrontala cortex (mPFC: anteroposterior (AP): 1, 7 mm, mediolateralt (ML): ± 0, 5 mm från bregma, dorsoventral (DV): -2 mm från skallen) enligt atlasen (Paxinos och Franklin, 1997), 30 minuter före NORT-träningspasset. Doserna av 7-OH-DPAT, som användes som en dopamin-D3-receptoragonist, baserades på tidigare rapporter som demonstrerade aktivering av dopamin-D3-receptorer i låga doser och ökad beläggning av dopamin-D2-receptorer vid högre doser (> 0, 3 mg / kg) (Ahlenius och Salmi, 1994; Daly och Waddington, 1993; Levant et al, 1996; Pritchard et al, 2003). Doserna av blonanserin och olanzapin som användes i den aktuella studien bestämdes i tidigare experiment (Enomoto et al, 2005; Nagai et al, 2003). Doserna för de andra läkemedlen baserades också på tidigare publikationer (Mori et al, 1997; Nagai et al, 2003; Noda et al, 2010). Alla föreningar utom H-89 administrerades systemiskt med en volym av 0, 1 ml / 10 g kroppsvikt. Kontrollmöss fick samma volym fordon.

NORT

Uppgiften utfördes dagarna 1–5 efter den slutliga injektionen av PCP i enlighet med metoden som beskrivs av Hida et al (2014), med en mindre modifiering. Experimentanordningen bestod av en öppen fältlåda av Plexiglas (30 cm × 30 cm × 35 cm), vars golv var täckt med pappersbäddar. Apparaten placerades i ett ljudisolerat rum.

NORT-förfarandet bestod av tre sessioner: vana, träning och kvarhållning. Varje mus var individuellt vanad vid lådan, med 10 min utforskning i frånvaro av föremål på var och en av de tre på varandra följande dagarna (habituationssessioner). Under träningen på dag 4 var två föremål (A och B) symmetriskt fixerade på lådans golv, 8 cm från sidoväggarna. Experimenteraren använde ett par stoppur för att spela in tiden för att utforska varje objekt. En mus placerades sedan i mitten framför lådan, och den totala tiden som användes för att utforska de två föremålen registrerades under 10 minuter. Utforskning av ett föremål definierades som att rikta näsan till föremålet på ett avstånd av <2 cm och / eller vidröra det med näsan. Efter träningspasset återfördes musen omedelbart till sin hembur. Under kvarhållningssessionen på dag 5 återfördes musen till samma ruta 24 timmar efter träningssessionen, med ett av de välkända föremålen (t.ex. A) som användes under träningssessionen ersatt av ett nytt objekt, C. Musen var tillåtet att utforska fritt i 10 minuter, och den tid som använts för att utforska varje objekt registrerades som tidigare. Under experimenten användes föremålen på ett motviktigt sätt vad gäller deras fysiska komplexitet och emotionella neutralitet. Ett preferensindex - förhållandet mellan tid som använts för att utforska endera av de två objekten (träningspass) eller det nya objektet (kvarhållningssession) och den totala tid som spenderades på att utforska båda objekten - användes för att bedöma kognitiv funktion, t.ex. / (B + A) × 100 (%) i träningspasset, och B eller C / (B + C) × 100 i kvarhållningssessionen. För att analysera lokomotorisk aktivitet delades golvet i det öppna fältet upp i 16 identiska kvadrater, och antalet gånger som en mus korsade från en kvadrat till en annan under 10 minuter.

Mikrodialys

På dag 16 efter start av PCP-administrering (den andra dagen efter PCP-borttagning) bedövades mössen med natrium pentobarbital (50 mg / kg, ip) och fixerades i en stereotaxisk apparat (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). En ledningskanyl (AG-4; Eicom, Kyoto, Japan) implanterades i mPFC (AP: -1, 7 mm, ML: 0, 3 mm från bregma, DV: -1, 5 mm från skallen) enligt atlasen. På dag 17 (24 timmar efter implantation av ledningskanylen och den tredje dagen efter PCP-borttagning) implanterades en dialysprobe (AI-4-02; membranlängd 2 mm, Eicom) i mPFC och Ringer-lösning (147 mM). NaCl, 4 mM KCl och 2, 3 mM CaCl2) perfunderades med en flödeshastighet av 1, 0 | il / min. Dialysatet uppsamlades var tionde minut, och dopaminkoncentrationen bestämdes med användning av ett HPLC-system (HTEC-500; Eicom) med elektrokemisk detektion. Tre prover togs för att fastställa baslinjenivåer av extracellulär dopamin. Efter behandling med blonanserin eller olanzapin uppsamlades dialysat under ytterligare 240 minuter med Ringer-perfusion som tidigare.

Western Blotting-analys

Western blotting utfördes som tidigare beskrivits (Hida et al, 2014) med en mindre modifiering. Mössen dödades av halshuggning efter träningspasset NORT och hjärnan avlägsnades omedelbart. MPFC-, hippocampus- och striatum-proverna dissekerades enligt atlas. Kanin anti-fosfo-PKA (Thr 197 ) (1: 1000; Cell signalering), kanin anti-PKA (1: 1000; Cell signalering), kanin anti-fosfo-NR1 (Ser 897 ) (1: 1000; Millipore), kanin-anti-fosfo-NR1 (Ser 896 ) (1: 1000; Upstate Biotechnology), kanin-anti-NR1 (1: 1000; Santa Cruz) och get-anti- p- aktin (1: 500, Santa Cruz Biotechnology) antikroppar används som primära antikroppar. Pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-kanin (1: 2000; Kierkegaard & Perry Laboratories) och anti-get IgG (1: 1000; Kierkegaard & Perry Laboratories) användes som sekundära antikroppar. För att utvärdera PKA- eller NRl-aktivering normaliserades fosforylerade PKA- eller NRl-nivåer till totala PKA- eller NR-1-nivåer på samma membran, och sedan normaliserades varje fosforylerad / totalnivå till de basala fosforylerade / totala nivåerna av saltkontrollmöss.

RT-PCR i realtid

Total RNA isolerades med användning av ett NucleoSpin RNA-kit (Takara Bio, Otsu, Japan). Omvänd transkription utfördes med ett PrimeScript RT-reagenspaket (Perfect Real Time; Takara Bio) under de förhållanden som rekommenderas av tillverkaren. PCR-analys i realtid genomfördes med SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio). Data samlades in med användning av ett StepOnePlus-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De använda NR1-primrarna från mus var som följer: 5'-ACTCCCAACGACCACTTCAC-3 '(framåt) och 5'-GTAGACGCGCATCATCTCAA-3' (omvänd). Partiella cDNA-sekvenser av mus NR1 har deponerats i National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank-databasen (anslutningsnummer: BC039157). Alla primrar köptes från Takara Bio. PCR-förhållandena i realtid var som följer: amplifiering bestod av ett initialt steg (95 ° C under 30 s), 40 cykler av denaturering under 5 s vid 95 ° C och glödgning under 1 min vid 60 ° C. Uttrycksnivåerna av NRl analyserad genom realtid RT-PCR kvantifierades genom jämförelse med en standardkurva och normaliserades relativt nivåerna av glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas ( GAPDH ).

Statistisk analys

Statistisk signifikans bestämdes med användning av envägsanalys av varians (ANOVA) eller tvåvägs ANOVA med upprepade mätningar, följt av Bonferronis test och Fishers PLSD-test för multigroupjämförelser. p- värden <0, 05 togs för att indikera betydelse.

RESULTAT

Effekt av Blonanserin på nedsatt synminne hos möss som fick upprepad PCP-administration i jämförelse med Olanzapins

Vi undersökte om PCP-inducerad kognitiv försämring vändes av blonanserin såväl som olanzapin, en av de atypiska APD: erna. En dag efter PCP-tillbakadragande utsattes möss för NORT. Blonanserin (1 och 3 mg / kg, po) och olanzapin (1 och 3 mg / kg, po) behandlades akut 30 minuter före träningspasset.

Såsom visas i figur la och c reducerade upprepad PCP-administration signifikant den undersökande preferensen för ett nytt objekt i retentionssessionen, jämfört med upprepad saltlösningsadministration. Behandling med blonanserin (3 mg / kg, po) och olanzapin (3 mg / kg, po) förbättrade den kognitiva försämringen hos PCP-administrerade möss signifikant utan att påverka undersökningsförmågan hos saltadministrerade möss (figur 1a och c). Hos PCP-administrerade möss påverkade varken blonanserin eller olanzapin undersökningsförmågan mellan föremålen i träningssessionen. Dessutom påverkade varken läkemedlet den totala undersökningstiden i varken träningen eller kvarhållningssessionerna (figur Ib och d) Det var ingen skillnad i den lokomotoriska aktiviteten under träningen mellan PCP / vehikel- och PCP / blonanserin-administrerade möss eller mellan saltlösning / vehikel- och salt / blonanserin-administrerade möss (data visas inte).

Effekt av blonanserin på nedsatt synminne hos mus som administrerades PCP upprepade gånger i jämförelse med olanzapins. Förklarande preferenser, (a och c); total undersökningstid, (b och d). PCP-administrerade möss behandlades med blonanserin (a och b; 1 eller 3 mg / kg, po) eller olanzapin (c och d; 1 eller 3 mg / kg, po) 30 minuter före träningssessionen för det nya objektigenkänningstestet (NORT). Förklarande preferens mättes under en 10-minutersperiod. Värdena är medelvärden ± SEM ( n = 7–11). Tvåvägs ANOVA: blonanserin: Sal: session: F1, 20 = 27.996, p <0.01; PCP: session: F1 , 33 = 24.470, p <0.01, administration: F2, 33 = 10.414, p <0.01, (a); olanzapin: Sal: session: F1, 19 = 12, 306, p <0, 01; PCP: session: F1 , 32 = 30.583, p <0.01, administration: F2 , 32 = 8.335, p <0.01, session × administration: F2, 32 = 3.570, p <0, 05, (c). Förklarande preferens: enkelriktad ANOVA: blonanserin: retention: F4 , 35 = 5.851, p <0.01, (a); olanzapin: retention: F4 , 33 = 4, 364, p <0, 01, (c). * p <0, 05 = signifikant skillnad jämfört med möss som fick saltlösning, sedan fordon (Sal / Veh). # p <0, 05 = signifikant skillnad jämfört med möss som fick PCP, sedan fordon (PCP / Veh) (Bonferroni / Dunn-test). BNS, blonanserin; OLZ, olanzapin; PCP, phencyclidine; Sal, saltlösning; Fordon, fordon.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Involvering av serotonin 5-HT 2A och dopamin-D 3- receptorer i den kognitiva förbättringseffekten av blonanserin i PCP-administrerade möss

Blonanserin har visat sig ha en hög affinitet inte bara för dopamin-D2-receptorer utan också för serotonin 5-HT2A och dopamin-D3-receptorer (Tenjin et al, 2013). För att bestämma om den lindrande effekten av blonanserin på PCP-inducerad kognitiv försämring involverar serotonin 5-HT2A- eller dopamin-D3-receptorer, använde vi DOI, en serotonin 5-HT2A-receptoragonist och 7-OH-DPAT, en dopamin- D3-receptoragonist, genom att testa deras effekt på den kognitiva förbättringen inducerad av blonanserin i PCP-administrerade möss.

Under NORT-träningen var det ingen skillnad i utforskande preferens för objekten i alla grupper (figur 2). DOI (3 mg / kg, ip) förhindrade signifikant och fullständigt de lindrande effekterna av blonanserin och olanzapin på nedsatt synminne i PCP-administrerade möss (figur 2a och c). 7-OH-DPAT (0, 05 mg / kg, ip) förhindrade också signifikant och fullständigt den lindrande effekten av blonanserin (figur 2e), medan den inte hade någon effekt på olanzapins (figur 2g).

Involvering av serotonin 5-HT2A och dopamin-D3-receptorer i mekanismen genom vilken blonanserin förbättrar kognitiv försämring av PCP-administrerade möss. Förklarande preferenser, (a, c, e och g); total undersökningstid, (b, d, f och h). Möss behandlades med DOI (3 mg / kg, ip) eller 7-OH-DPAT (0, 05 mg / kg, ip) 5 eller 60 minuter före NORT-träningssessionen. En grupp fick blonanserin (3 mg / kg, po) och en grupp olanzapin (3 mg / kg, po), båda 30 minuter före träningspasset. Förklarande preferens mättes under en 10-minutersperiod. Värden indikerar medelvärdet ± SEM ( n = 6–10). Tvåvägs ANOVA: blonanserin / DOI: Sal: session: F1, 17 = 23.501, p <0.01; PCP: session: F1 , 38 = 16.153, p <0.01, administration: F2, 38 = 7.222, p <0.01, (a); olanzapin / DOI: Sal: session: F1, 16 = 23.397, p <0.01; PCP: session: F1 , 37 = 21, 794, p <0, 01, administration: F2 , 37 = 10, 620, p <0, 01, session × administration: F2 , 37 = 4, 109, p <0, 05, (c); blonanserin / 7-OH-DPAT: Sal: session: F1, 17 = 16.890, p <0.01; PCP: session: F1 , 28 = 16.363, p <0.01, administration: F2, 28 = 4.828, p <0, 05, (e); olanzapin / 7-OH-DPAT: Sal: session: F1, 13 = 33.049, p <0.01; PCP: session: Fl , 25 = 33, 067, p <0, 01, administration: F2 , 25 = 4, 580, p <0, 05, session × administration: F2, 25 = 5, 049, p <0, 05, (g). Förklarande preferens: enkelriktad ANOVA: blonanserin / DOI: retention: F4, 36 = 10.250, p <0.01, (a); olanzapin / DOI: retention: F4 , 35 = 7, 067, p <0, 01, (c): blonanserin / 7-OH-DPAT: retention: F4, 29 = 6.329, p <0.01, (e); olanzapin / 7-OH-DPAT: retention: F4 , 25 = 6.923, p <0.01, (g). * p <0, 05 jämfört med mottagande möss (Sal / Veh / Veh)); # p <0, 05 jämfört med mottagande möss (PCP / Vehicle / Vehicle); $ p <0, 05 jämfört med mottagande möss (PCP / BNS / Veh); p <0, 05 jämfört med mössmottagning (PCP / OLZ / Veh) (Bonferroni / Dunn-test). BNS, blonanserin; DPAT, 7-OH-DPAT; NS, inte signifikant; OLZ, olanzapin; PCP, phencyclidine; Sal, saltlösning; Fordon, fordon.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

I saltlösande kontrollmöss hade DOI och 7-OH-DPAT vid de använda doserna ingen effekt på de nya objektigenkänningsföreställningarna (figur 2). Den blockerande effekten av DOI och 7-OH-DPAT på blonanserin- och olanzapin-inducerad förbättring av undersökningspreferensreducering i PCP-administrerade möss var inte associerad med förändringar i den totala undersökningstiden (figur 2b, d, f och h).

Effekt av blonanserin på extracellulär dopamin i mPFC för PCP-administrerade möss: involvering av serotonin 5-HT2A och dopamin-D 3- receptorer

Vi har tidigare visat att upprepad PCP-administration avaktiverar dopaminerg neurotransmission i mPFC för möss, där sådan överföring är nödvändig för visuellt igenkänningsminne (Mouri et al, 2007; Nagai et al, 2009). Vi frågade om blonanserin och olanzapin, i en dos (3 mg / kg) som förbättrar den kognitiva försämringen av PCP-administrerade möss, underlättar dopaminfrisättning i mPFC för PCP-administrerade möss.

Vår tidigare studie visade att halterna av extracellulär dopamin minskade något i mPFC för PCP-administrerade möss jämfört med saltlösningsadministrerade möss, och förändringen i basnivåerna speglades i det dopaminergiska svaret på kaliumstimulering vid en hög koncentration (Wang et al, 2007). Det fanns ingen skillnad i basnivåerna av extracellulär dopamin i mPFC för några PCP-administrerade grupper i den aktuella studien (data visas inte). Såsom visas i figur 3 orsakade blonanserin och olanzapin en markant ökning i halterna av extracellulär dopamin i mPFC hos PCP-administrerade möss (figur 3). När DOI (3 mg / kg, ip) administrerades 25 minuter efter behandling med blonanserin eller olanzapin minskades ökningarna i nivåerna av extracellulär dopamin inducerad av antingen läkemedel avsevärt (figur 3a och b). 7-OH-DPAT (0, 05 mg / kg, ip) inhiberade också signifikant blonanserin-inducerade ökningar i nivåerna av extracellulär dopamin (figur 3c), men det hämmar inte den dopaminökande effekten av olanzapin (figur 3d). 7-OH-DPAT eller DOI i frånvaro av någon APD påverkade inte nivåerna av extracellulär dopamin i mPFC (figur 3a – d).

Effekt av blonanserin på nivån av extracellulär dopamin i det mediala prefrontala cortex (mPFC) hos PCP-administrerade möss. PCP-administrerade möss behandlades med DOI (3 mg / kg, ip) (a och b) eller 7-OH-DPAT (0, 05 mg / kg, ip) (c och d) 25 minuter efter (DOI) eller 30 minuter före (7-OH-DPAT), blonanserin (3 mg / kg, po) eller olanzapin (3 mg / kg, po) behandlingar. Värden indikerar medelvärdet ± SEM ( n = 4–5). Tvåvägs ANOVA: blonanserin / DOI: administration: F2 , 10 = 48.389, p <0.01, administration × tid: F 48, 240 = 1.914, p <0.01, (a); olanzapin / DOI: administrering: F2 , 9 = 5, 554, p <0, 05, administration × tid: F 48, 216 = 2, 526, p <0, 01, (b); blonanserin / 7-OH-DPAT: administration: F2 , 10 = 5, 217, p <0, 05, administration × tid: F 48, 240 = 2, 034, p <0, 01, (c); olanzapin / 7-OH-DPAT: administration × tid: F 48, 216 = 2, 311, p <0, 01, (d). ** p <0, 01 jämfört med mottagande möss (PCP / BNS / Veh); ## p <0, 01 jämfört med mottagande möss (PCP / OLZ / Vehicle); $$ p <0, 01 jämfört med mössmottagning (PCP / Veh / DPAT) (Bonferroni / Dunn-test). BNS, blonanserin; DPAT, 7-OH-DPAT; OLZ, olanzapin; PCP, phencyclidine; Fordon, fordon.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Involvering av intracellulär signalering genom Dopamin-D 1- receptorer i kognitiv förbättring av Blonanserin i PCP-administrerade möss

Tidigare studier har visat att när upprepad PCP-administration inducerar kognitiv försämring hos möss, åtföljs försämringen av dysfunktion av dopamin-D1-receptorerna i mPFC (Mouri et al, 2007). Vi frågade om den lindrande effekten av blonanserin följer av de ökade nivåerna av extracellulär dopamin som APD inducerar i mPFC, och verkar genom aktivering av dopamin-D1-receptorn till PKA-signalering.

SCH23390 (0, 02 mg / kg, sc), en dopamin-D1-receptorantagonist och H-89 (0, 1 nmol / ul, bilateralt), en PKA-hämmare, förhindrade signifikant och fullständigt den förbättrade effekten av blonanserin på PCP-inducerad kognitiv försämring (Figur 4a och e) men inte H-89 (0, 03 nmol / ul) (figur 4c). Utforskande preferenser mellan objekt under träningspasset påverkades inte. I saltkontrollmöss hade SCH23390 och H-89 ingen effekt på prestandan för igenkänning av nya objekt (figur 4a, c och e). I PCP-administrerade möss hade SCH23390 och H-89 inte heller någon effekt på den totala undersökningstiden i varken träningen eller kvarhållningssessionerna (figur 4b, d och f).

Involvering av intracellulär signalering genom dopamin-Dl-receptorer i mekanismen genom vilken blonanserin förbättrar den kognitiva försämringen av PCP-administrerade möss. Förklarande preferenser, (a, c och e); total undersökningstid, (b, d och f). PCP-administrerade möss behandlades med SCH23390 (0, 02 mg / kg, sc), H-89 (0, 03 eller 0, 1 nmol / ul) och blonanserin (3 mg / kg, po) 60, 30 respektive 30 min före NORT-träningen. Förklarande preferens mättes under en 10-minutersperiod. Värden indikerar medelvärdet ± SEM ( n = 5–8). Tvåvägs ANOVA: blonanserin / SCH23390: Sal: session: F1, 11 = 9.068, p <0, 05; PCP: administration: F2 , 21 = 9.451, p <0.01, session × administration: F2, 21 = 4.959, p <0, 05; (en); blonanserin / H-89 (0, 03): Sal: session: F1, 21 = 22.757, p <0.01; PCP: session: F 1, 59 = 22, 865, p <0, 01, administration: F 2, 59 = 7, 086, p <0, 01; (C); blonanserin / H-89 (0, 1): Sal: session: F1, 15 = 8.126, p <0, 05; PCP: administration: F2 , 28 = 4, 576, p <0, 05, session × administration: F2, 28 = 5, 614, p <0, 01; (E). Envägs ANOVA: explorerande preferens: blonanserin / SCH23390: retention: F 4, 21 = 9.032, p <0.01, (a): blonanserin / H-89 (0, 03): retention: F 4, 51 = 8.728, p <0.01 (c): blonanserin / H-89 (0, 1): retention: F4, 27 = 9, 483, p <0, 01, (e). * p <0, 05 jämfört med mottagande möss (Sal / Veh / Veh)); # p <0, 05 jämfört med mottagande möss (PCP / Vehicle / Vehicle); $ p <0, 05 jämfört med mössmottagande (PCP / BNS / Veh) (Bonferroni / Dunn-test). BNS, blonanserin; NS, inte signifikant; PCP, phencyclidine; Sal, saltlösning; SCH, SCH23390; Fordon, fordon.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

De fosfolyrerade nivåerna av PKA vid Thr 197 i de PCP-administrerade mössen minskade signifikant i mPFC jämfört med de i saltlösande kontrollmöss (figur 5a) men inte i hippocampus eller striatum (kompletterande figur S1a och c). Blonanserin (3 mg / kg) korrigerade signifikant minskningen i fosforyleringsnivåer, och denna effekt blockerades signifikant av SCH23390 i mPFC (figur 5a). Det fanns ingen signifikant gruppvis variation i nivåerna för total PKA (figur 5b, kompletterande figur Sb och d).

Effekt av blonanserin på Thr 197- fosforylerad PKA och Ser 897 - eller Ser 896- fosforylerad NR1 i det mediala prefrontala cortex (mPFC) hos PCP-administrerade möss. PCP-administrerade möss behandlades med SCH23390 (0, 02 mg / kg, sc) och blonanserin (3 mg / kg, po) under 60 respektive 30 minuter före NORT-träningssessionen. Omedelbart efter träningsförsöket halshuggdes möss och därefter Thr 197- fosforylerad PKA (a) eller NR1 (c, Ser 897 ; d, Ser 896 ) och total PKA (b) eller NR1 (e) uttryck i mPFC bestämd genom western blotting-analys. Representativ western blot och fosforylerad PKA / total PKA eller fosforylerad NR1 / total NR1 immunoreaktivitet i mPFC. Värden indikerar medelvärdet ± SEM ( n = 5–9). Envägs ANOVA: PKA: F 3, 32 = 4, 046, p <0, 01, (a); NRl Ser 897 : F3 , 19 = 4, 046, p <0, 05, (c). * p <0, 05 jämfört med mottagande möss (Sal / Veh / Veh)); # p <0, 05, ## p <0, 01 jämfört med mottagande möss (PCP / Vehicle / Vehicle); $$ p <0, 01 jämfört med mössmottagande (PCP / BNS / Vehicle) (Fishers PLSD-test). BNS, blonanserin; PCP, phencyclidine; Sal, saltlösning; SCH, SCH23390; Fordon, fordon.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Det är välkänt att PKA-fosforylerade NR1, en väsentlig underenhet av NMDA-receptorer, vid Ser 897 och reglerar dess funktioner (Mouri et al, 2007). För att ytterligare undersöka mekanismen genom vilken blonanserin förbättrar försämringen av visuellt igenkänningsminne i PCP-administrerade möss undersökte vi effekten av blonanserin på Ser 897- fosforyleringsnivån av NR1 i mPFC, hippocampus och striatum av PCP-administrerade möss direkt efter träningen. Utan blonanserin sjönk Ser 897- fosforyleringsnivåerna vid denna punkt signifikant jämfört med saltlösningskontrollmöss i mPFC (figur 5c) men inte hippocampus eller striatum (kompletterande figur S2a och c). Blonanserin (3 mg / kg) korrigerade signifikant minskningen i fosforyleringsnivåer, och denna effekt blockerades signifikant av SCH23390 i mPFC (figur 5c). Men det fanns ingen signifikant skillnad i nivåerna av NR1 fosforylerad vid Ser 896 (i motsats till Ser 897 ), som fosforyleras av PKC (i motsats till PKA), i mPFC (figur 5d), hippocampus eller striatum (data visas inte) i alla grupper. Det fanns ingen signifikant gruppvis variation i nivåerna för total NR1 (figur 5e, kompletterande figur S2b och d). MRNA-nivåerna av NR1 var inte heller signifikant olika i mPFC, hippocampus eller striatum (kompletterande figur S3).

DISKUSSION

Vi har bekräftat att PCP-administrerade möss visar nedsatt nyhetsdiskriminering i NORT som överensstämmer med tidigare rapporter (Nagai et al, 2009). Det är osannolikt att den försämring som dessa möss uppvisar i inlärnings- och minnesuppgifter beror på förändringar i motivation relativt kontrollerna, även om olika motivationsprocesser är involverade i beteendeuppgiften. Det faktum att PCP minskade den undersökande preferensen för nya föremål i kvarhållningssessionen kan tolkas som neofobi. Emellertid kan involvering av motivation och / eller neofobi uteslutas, eftersom PCP-administration inte hade någon effekt på den totala tiden som ägnades åt utforskning av nya objekt under träningspasset. Därför är det troligt att prestationsnedsättningen som ses hos PCP-administrerade möss beror på inlärnings- och / eller minnesunderskott.

Blonanserin hämmar serotonin 5-HT 2A och dopamin-D 2/3 receptorer (Tenjin et al, 2013). Blonanserin förbättrade signifikant den kognitiva försämring som inducerades av PCP, vilket sågs i NORT, men vid en dos av 3 mg / kg hade det ingen effekt på den totala undersökningstiden som registrerades under träningssessionen. Det är osannolikt att den observerade förbättringen av försämrad arbetsuppgift berodde på förändringar i motivation hos PCP-administrerade möss. Blonanserin hade inte heller någon effekt på prestanda, såsom förstärkning av visuellt igenkänningsminne i sig själv i saltlösningsadministrerade möss. Liknande fenomen observerades i olanzapinbehandlade, saltlösande och PCP-administrerade möss. Därför verkar det som om blonanserin och olanzapin förbättrar försämringen av visuellt igenkänningsminne orsakat av upprepad PCP-administrering hos möss. Dessutom kan effekten av blonanserin på försämring av visuellt igenkännande minne bero på en effekt i förvärv ('lärande'), inte konsolidering eller retention ('minne'), eftersom de PCP-administrerade mössen behandlades med blonanserin före träning, inte efter träningen eller före testövningarna.

Den lindrande effekten av blonanserin på försämring av visuellt igenkänningsminne förhindrades genom behandling med DOI, en serotonin 5-HT2A-receptoragonist och 7-OH-DPAT, en dopamin-D3-receptoragonist, i doser som inte signifikant påverkade prestanda hos saltlösningskontrollmöss. Våra resultat med 7-OH-DPAT bör tolkas i samband med den kända selektiviteten för 7-OH-DPAT vid dopamin-D3 mot -D2-receptorer. Vi hade redan funnit att haloperidol, en dopamin-D2-receptorantagonist, inte lyckades vända försämring av visuellt igenkänningsminne i PCP-administrerade möss (Nagai et al, 2009), vilket indikerar ingen associering av dopamin-D2-receptorantagonism med förbättrad den PCP-inducerade försämringen. Vi demonstrerade att resultaten med 7-OH-DPAT förhindrade den lindrande effekten av blonanserin genom dopamin-D3-receptorerna. Olanzapine förbättrade också PCP-inducerad försämring av visuellt igenkänningsminne; effekten avbröts emellertid endast av DOI, inte av 7-OH-DPAT. Från de nuvarande resultaten och rapporterar att blonanserin har en högre affinitet för dopamin-D3-receptorer än olanzapin (Ki = 0, 49 nM vs 49 nM) (DeLeon et al, 2004; Tenjin et al, 2013) är vår slutsats att blonanserin förbättrar PCP-inducerad kognitiv nedsättning genom antagonisering av både serotonin 5-HT 2A och dopamin-D3-receptorer och visar en farmakologisk effekt som skiljer sig från olanzapins effekt.

Å andra sidan förstärkte subeffektiv dos av tandospiron förmågan hos blonanserin att motverka PCP-inducerad kognitiv försämring (Horiguchi och Meltzer, 2013), även om blonanserin själv har låg affinitet för serotonin 5-HT 1A- receptorer (Ki = 804 nM; Tenjin et al, 2013). Det kan inte uteslutas att trots sin markant lägre affinitet för serotonin 5-HT 1A- receptorer än för serotonin 5-HT2A / dopamin-D3-receptorer i bindningsstudier, kan blonanserin stimulera serotonin 5-HT 1A- receptorer via en allosterisk eller annan mekanism (Horiguchi och Meltzer, 2013). Ytterligare studier kommer att behövas för att klargöra det funktionella förhållandet mellan serotonin 5-HT 2A / dopamin-D3 och 5-HT 1A- receptorer i den förbättrade effekten av blonanserin på kognitiv försämring.

Ackumulering av bevis tyder på att det dopaminergiska systemet i mPFC är involverat i kognitiv funktion. Exempelvis störningar av dopaminerg neurotransmission i mPFC för icke-mänskliga primater genom infusion av dopamin-D1-receptorantagonister eller genom excitotoxisk skada försvårar utförandet av objektsöknings-omväg och fördröjd-svar-uppgifter (Dias et al, 1996a, 1996b; Sawaguchi och Goldman-Rakic, 1991). Följaktligen kan kognitiva nedsättningar vid schizofreni vara förknippade med underskott i dopaminerg neurotransmission i mPFC. Serotonin 5-HT 2A- receptorer distribueras i stor utsträckning i hjärnan, med deras högsta koncentrationer i cortex (Hoyer et al, 1986; Meltzer et al, 2003). De atypiska APD: erna, representerade av olanzapin och risperidon, underlättar dopaminfrisättning i mPFC, striatum och hypofys genom antagonism av serotonin 5-HT2A-receptorer. De underlättande effekterna av atypiska APD: er på dopaminfrisättning i dessa regioner är kritiska för att förbättra kognitiva försämringar, negativa symtom och biverkningar av APD: er, såsom EPS och hyperprolactinemia (Meltzer och McGurk, 1999). De tidigare och nuvarande mikrodialysexperimenten in vivo visade att de basala extracellulära dopaminnivåerna i mPFC hos PCP-administrerade möss minskade något (Wang et al, 2007) och att både blonanserin och olanzapin signifikant ökade frisättningen av dopamin i mPFC från PCP-administrerade möss i samma dos som förbättrad kognitiv försämring. Dessa dopaminfrisättningseffekter av blonanserin och olanzapin antagoniserades av DOI. Resultaten antyder att antagonismen hos serotonin 5-HT 2A- receptorer av blonanserin och olanzapin åtminstone delvis är ansvarig, via underlättande av frisättning av dopamin i mPFC, för att förbättra PCP-inducerad kognitiv försämring.

Å andra sidan har dopamin-D3-receptorer en dubbel roll som autoreceptorer och postsynaptiska receptorer vid dopaminerga synapser (Diaz et al, 1995; Diaz et al, 2000; Levesque et al, 1992). Farmakologiska studier tyder på att dopamin-D 3- receptorer fungerar som autoreceptorer negativt modulerar frisättning av dopamin (Gross och Drescher, 2012). Ohno et al (2010) fann att AD-6048, en primär metabolit av blonanserin, visar en högre affinitet för dopamin-D3-receptorer än för dopamin-D2-receptorer, vilket åtminstone delvis förklarar den atypiska naturen hos blonanserin och dess låga EPS ansvar. Faktum är att selektiva dopamin-D3-receptorantagonister är kända för att dämpa APD-inducerade EPS, och APD: er som aktiverar mesolimbiska dopaminergiska system visar reducerat EPS-ansvar (Gyertyan och Saghy, 2007; Gyertyan et al, 2008; Millan et al, 1997; Perrault et al, 1997). Antagonism av dopamin-D3, men inte D2, receptorer kan också förbättra den kortikala kognitiva funktionen genom att underlätta frisättningen och syntesen av dopamin av det mesokortiska dopaminergiska systemet (Gobert et al, 1995; Gross och Drescher, 2012; Nakajima et al, 2013 ; Watson et al. 2012a, 2012b). Vi fann att den hämmande effekten av blonanserin, men inte av olanzapin, på dopaminfrisättning antagoniserades av 7-OH-DPAT i samma dos som antagoniserade den lindrande effekten av blonanserin på kognitiv försämring. Dessa resultat tyder starkt på att blonanserin förbättrar PCP-inducerad försämring av visuellt igenkänningsminne genom antagonisering av dopamin-D3-receptorer, förutom serotonin 5-HT2A-receptorer, och därigenom stimulerar frisättningen av dopamin i mPFC.

Tidigare studier har visat att de kognitiva nedsättningarna i PCP-administrerade möss åtföljs av dysfunktion av dopamin-D1 (men inte dopamin-D2) och / eller NMDA-receptorer i mPFC (Abekawa et al, 2006). Coimmunoprecipitationsstudier med homogenat från mPFC såväl som hippocampus har visat att dopamin-D 1- receptorer är tillräckligt nära NR1-underenheten för att påverka dess aktivitet (Kruse et al, 2009). Fysiologiska studier in vitro med användning av pyramidala celler från mPFC hos råttor har visat att NMDA-receptorfunktioner underlättas av en dopamin-Dl-receptoragonist, SKF38393, och underlättandet är beroende av PKA och intracellulärt kalcium (Tseng och O'Donnell, 2004) . I den aktuella studien blockerades den lindrande effekten av blonanserin på PCP-inducerad kognitiv försämring fullständigt av förbehandling med en dopamin-Dl-receptorantagonist, SCH23390, eller en PKA-hämmare, H-89, i doser som inte påverkade funktionen hos saltkontroll möss. Det är osannolikt att den relativt höga affiniteten hos SCH23390 för serotonin 5-HT2A-receptorer har en roll i dess antagonism, eftersom (+) SCH23390 vid de doser som användes i den här studien inte påverkar in vivo- bindningen av [3H] spiperon i råttens prefrontala cortex (Bischoff et al, 1986). Det vill säga SCH23390 antagoniserar selektivt dopamin-D1-receptorer, vilket gör det möjligt för den att verka oberoende av serotonin 5-HT2A-receptorer. Blonanserin avhjälpte signifikant minskningen i halterna av Thr 197- fosforylerad PKA, och denna effekt blockerades signifikant av SCH23390 i mPFC för PCP-administrerade möss. Följaktligen antyder dessa resultat att den förbättrade effekten av blonanserin på PCP-inducerad kognitiv försämring är relaterad till aktiveringen av dopamin-D1-receptor-PKA-signalering i mPFC. I framtiden krävs emellertid en mer direkt undersökning för att detektera PKA-enzymaktivitet för att bestämma sambandet mellan den fosforylerade formen och enzymaktiviteten hos PKA. De onormalt minskade nivåerna av Ser 897- fosforylerad NR1, som fosforyleras av PKA, i mPFC för PCP-administrerade möss ökades signifikant med blonanserin, varvid effekten blockerades av SCH23390. Det fanns ingen signifikant skillnad i nivåerna av Ser 896- fosforylerad NR1, som fosforyleras av PKC snarare än PKA, i mPFC i någon grupp. De upptäckta effekterna observerades inte i hippocampus eller striatum. Ytterligare experiment behövs för att klargöra hjärnregionens specifika effekt av blonanserin, eftersom det kan orsakas av skillnaden i neuronala projektioner eller receptoruttryck och / eller känslighet för effekterna av blonanserin i varje hjärnregion (Gurevich och Joyce, 1999; Marek, 2007). Våra resultat tyder på att dopamin-D1-receptor-PKA-signalering krävs för att förbättra effekten av blonanserin på kognitiv försämring. Dessutom är aktivering av NMDA-receptorer i mPFC via dopamin-Dl-receptor-PKA, men inte PKC, signalering avgörande för visuellt igenkänningsminne i PCP-administrerade möss.

In conclusion, the ameliorating effect of blonanserin on PCP-induced cognitive impairment is associated with indirect activation of NMDA receptors due to Ser 897 -phosphorylation of the NR1 subunit, a step linked to dopamine-D 1 receptor-PKA signaling following facilitation of dopamine release in vivo . The latter is due to a dual antagonism of serotonin 5-HT 2A and dopamine-D 3 receptors by blonanserin. These findings also provide in vivo evidence that blonanserin augments dopaminergic neurotransmission in the mPFC through antagonizing of dopamine-D 3 receptors.

FINANSIERING OCH AVSLUTNING

This study was supported by the 'Academic Frontier' Project for Private Universities (2007–2011) and Grants-in-Aid for Scientific Research C (24590219 and 26460240) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (MEXT) of Japan; Research on Risk of Chemical Substances (2008–2010), Health and Labor Science Research Grants supported by the Ministry of Health, Labor and Welfare (MHLW); a Meijo University Research Institute grant; a Smoking Research Foundation Grant for Biomedical Research (SRF); the Joint Research Project under the Japan–Korea basic scientific cooperation program (2010–2012) from the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS); the Adaptable and Seamless Technology Transfer Program Through Target-driven R&D (AS251Z02986P, AS251Z03018Q), Japan Science and Technology Agency; a Grant-in-Aid for the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Fellows; and a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, 'Glial Assembly: A New Regulatory Machinery of Brain Function And Disorders', and a Grant-in-Aid for 'Integrated Research on Neuropsychiatric Disorders' carried out under the Strategic Research Program for Brain Sciences by the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology of Japan. Dr Y Noda has received research support and speakers' honoraria from Dainippon Sumitomo. Dr N Ozaki has received research support or speakers' honoraria from, or has served as a consultant to, Abbvie, Asahi Kasei Pharma, Astellas, Dainippon Sumitomo, Eisai, Eli Lilly, GlaxoSmithKline, Janssen, Meiji Seika Pharma, Mochida, MSD, Novartis Pharma, Ono, Otsuka, Pfizer, Shionogi, Takeda, Tanabe Mitsubishi, Sanofi, and Yoshitomi. Dr K Iwamoto has received speakers' honoraria from Dainippon Sumitomo, Eisai, Eli Lilly, GlaxoSmithKline, Meiji Seika Pharma, Mochida, Otsuka, and Tanabe Mitsubishi. De andra författarna förklarar ingen intressekonflikt.

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • BC039157

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen Neuropsychopharmacology (//www.nature.com/npp)