Biosensorbaserade analyser för pqs, hhq och relaterade 2-alkyl-4-kinolonkvorumavkännande signalmolekyler | naturprotokoll

Biosensorbaserade analyser för pqs, hhq och relaterade 2-alkyl-4-kinolonkvorumavkännande signalmolekyler | naturprotokoll

Anonim

Abstrakt

2-Alkyl-4-kinoloner (AHQ), såsom 2-heptyl-3-hydroxi-4-kinolon (PQS) och 2-heptyl-4-kinolon (HHQ), är quorumavkännande signalmolekyler. Här beskriver vi metoder för AHQ-detektion, tentativ identifiering och kvantifiering, som använder en lux- baserad Pseudomonas aeruginosa AHQ-biosensorstam. Protokollet beskriver både tunnskiktskromatografi (TLC) och mikrotiterplattanalyser, som använder bioluminescens eller den gröna färgen på pyocyanin som detektionsändpunkter. Organiska lösningsmedelsextrakt av bakterieceller eller cellfria odlingssupernatanter kromatograferas på TLC-plattor, som torkas och överläggs med AHQ-biosensorn. AHQ visas både som självlysande och gröna fläckar. För mikrotiteranalysen tillsätts antingen förbrukade bakteriekultursupernatanter eller extrakt till ett tillväxtmedium innehållande AHQ-biosensorn. Ljusutmatningen är proportionell mot provets AHQ-innehåll. De beskrivna analyserna tar cirka 2 dagar att slutföra, är enkla att utföra, kräver inte sofistikerad instrumentering och är mycket mottagliga för screening av ett stort antal bakterieprover. Bortsett från PQS och HHQ i P. aeruginosa kommer definitiv AHQ-identifikation emellertid att kräva ytterligare MS- och NMR-analyser.

Introduktion

Bakterier frisätter en mängd olika små molekyler inklusive sekundära metaboliter såsom antibiotika och sideroforer (järnchelatorer), metaboliska slutprodukter och signal-till-cell-signalmolekyler. Det senare underlättar samordningen av genuttryck inom en bakteriepopulation 1, 2, 3, 4 . Cell-till-cell-kommunikation i bakterier benämns ”quorum sensing” (QS) och beror på verkan av diffusibla signalmolekyler eller ”autoinducers”. När en bakteriekultur växer frigörs signalmolekyler i det extracellulära miljön och ackumuleras. När en kritisk tröskelkoncentration av QS-signalmolekylen (och följaktligen en specifik befolkningstäthet) har uppnåtts, initieras en koordinerad förändring i bakteriebeteendet via ett specifikt sensorkinas eller svarreglerare, vilket underlättar uttrycket av QS-beroende målgener 1 2, 3, 4 . Sekundär metabolitproduktion, bioluminescens, kompetens, plasmidöverföring, biofilmutveckling och patogenicitet är alla kända för att kontrolleras av QS i många olika Gram-positiva och Gram-negativa bakterier.

QS-signalmolekyler är kemiskt olika och sträcker sig från peptider och N- acylhomoserinlaktoner (AHL) till furanoner och AHQs 1, 2, 3, 4 . Med tanke på det stora antalet extracellulära metaboliter, kommer den kemiska mångfalden bland kända QS-signalmolekyler troligen endast att representera "toppen av isberget". Det har faktiskt föreslagits att majoriteten av organiska föreningar med låg molekylvikt framställda och utsöndrade av mikrober sannolikt kommer att fungera som QS-signalmolekyler 5 .

Studier av QS i olika bakterier har haft stor nytta av tillgängligheten av biosensoranalyser, som reagerar känsligt på specifika QS-signalmolekylklasser och inte kräver sofistikerad instrumentering. Sådana analyser kan tillhandahålla tentativ information om den kemiska identiteten, antalet och koncentrationerna av QS-signalmolekylerna som finns i bakteriekultursupernatanter. Exempelvis kan AHL: er lätt detekteras och kvantifieras med användning av AHL-biosensorer baserade på lux 6, 7, gfp 8 eller lacZ 9- reportergenfusioner eller violaceinpigmentinduktion 10 medan autoinducer-2 generellt analyseras med användning av en bioluminescerande Vibrio harveyi- stam 11 .

Under 1940- och 1950-talet isolerades och renades ett antal antibakteriella AHQ-föreningar från P. aeruginosa- kultursupernatanter 4 . Därefter upptäcktes AHQ: er för att hämma tillväxten av Gram-positiva bakterier, alger och fytoplankton, för att modulera värdets immunförsvar, kelatjärn och fungera som QS-signalmolekyler 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 . Andra pseudomonader, Burkholderia och Alteromonas arter producerar också AHQ: er och det är mycket troligt att andra gramnegativa bakterier såsom Ralstonia- arter syntetiserar dessa föreningar eftersom de har homologer av P. aeruginosa och B. pseudomallei AHQ biosyntetiska gener 19 .

Även om över 50 olika AHQ: er har identifierats i P. aeruginosa , är de flesta närvarande i låga koncentrationer där de osannolikt är fysiologiskt aktiva 20, 21 . AHQ finns i en annan tautomer form och kan också benämnas 4-hydroxi-2-alkylkinoliner (HAQ) 17, 20 . Emellertid är den neutrala 4-kinolonen snarare än 4-hydroxikinolin den dominerande arten i pH-området 4–6 och därmed under fysiologiska förhållanden 17 ; så här använder vi AHQ snarare än HAQ-nomenklaturen. De huvudsakliga P. aeruginosa AHQ-signalmolekylerna är 2-heptyl-3-hydroxi-4 (lH) -kinolon ( Pseudomonas kinolonsignal (PQS)) och 2-heptyl-4-kinolon (HHQ, fig. 1) 16, 21, 22, 23 . Medan HHQ är den omedelbara föregångaren till PQS, kan den också fungera som en QS-signalmolekyl inte bara i P. aeruginosa utan också i Burkholderia pseudomallei 19 och förmodligen i andra AHQ-producerande bakterier, även om detta återstår att bekräftas.

Image

Bild i full storlek

AHQ-biosensoranalys

Här presenterar vi enkla biosensorbaserade protokoll som vi tidigare publicerade som underlättar snabb, kostnadseffektiv detektion och tentativ identifiering av AHQ, särskilt PQS och HHQ, i bakterieceller och kultursupernatanter 16, 17, 19 (MPF, SPD, S Crusz, SR Chhabra, MC och PW, opublicerat manuskript). Denna metod använder en P. aeruginosa- biosensor utformad för att svara på AHQ genom att avge bioluminescens och producera det gröna pigmentet pyocyanin. Analysen kan konfigureras för användning som ett detekteringssystem efter TLC av cell- eller supernatant-extrakt eller som en 96-brunnars mikrotiterplattanalys. Även om den kombinerade användningen av TLC och AHQ-biosensoröverlagring och syntetiska standarder för PQS och HHQ är mer än tillräckliga för att fastställa identiteten för dessa två AHQ i P. aeruginosa- kulturer, för andra bakterier och faktiskt andra AHQ som aktiverar biosensorn, ytterligare MS- och NMR-analys kommer att krävas för att entydigt identifiera AHQ-föreningen.

I P. aeruginosa beror AHQ-biosyntes på pqsABCDE- operon och mutation av pqsA gör organismen AHQ-negativ 19, 21, 24 . Både PQS och HHQ fungerar som autoinducerare eftersom de krävs för att driva sin egen syntes genom att binda till LysR-typregulatorn, PqsR (MvfR), så att PqsR (MvfR) -bindning till pqsA- promotorn förbättras 17, 23, 25 . För att konstruera en AHQ-biosensor raderade vi först pqsA i stam PAO1 innan vi införde en luxCDABE- baserad pqsA- promotor-fusion på kromosomen hos pqsA- mutanten 17 (MPF, SPD, S. Crusz, SR Chhabra, MC och PW, opublicerat manuskript) med användning av mini-CTX luxCDABE- plasmidsystemet beskrivet av Becher och Schweizer 26 . Surrogat- pqsA- promotorn infördes i ett icke-kodande ställe i kromosomen där den kan aktiveras oberoende av den nativa genpromotorn. Användningen av hela luxCDABE- operon dispenserar med behovet av att exogent tillföra ett långkedjigt fettaldehydsubstrat för luciferaset 7 . Figur 2 visar mekanismen genom vilken en AHQ såsom PQS aktiverar biosensorn och inducerar bioluminescens. Eftersom pqsA- mutanten inte producerar några AHQ, är den mörk och ljus avges endast vid exponering för en exogen AHQ-källa. Bioluminescens kan detekteras på TLC-plattaöverlagringar med användning av en röntgenfilm eller en fotonvideokamera eller kvantifieras med användning av en luminometer för vätskebaserade analyser. Eftersom P. aeruginosa inte är naturligt bioluminescerande, är biosensorbakgrundsbelysningsnivån mycket låg och den svarar på ett brett dynamiskt intervall av både PQS och HHQ, från nanomolära till mikromolära koncentrationer (MPF, SPD, S. Crusz, SR Chhabra, MC och PW, opublicerat manuskript). Även om den är mindre mottaglig för snabb kvantifiering producerar bioreporteren det blågröna pigmentpyocyaninet som svar på både PQS och HHQ, vilket lätt syns på TLC-överläggningarna. Vidare aktiveras AHQ-biosensorn mest känsligt av PQS och HHQ, som båda har C7-alkylkedjor. Analoger av båda föreningarna med alkylsidokedjor från Cl till C11 kan aktivera reportern om än vid högre koncentrationer (MPF, SPD, S. Crusz, SR Chhabra, MC och PW, opublicerat manuskript).

Image

( a ) PQS binder till PqsR (MvfR) och förbättrar PqsR-bindning till pqsA- promotorn, vilket resulterar i expression av luxCDABE- operon och produktion av proteinerna som krävs för ljusgenerering. ( b ) LuxAB bildar a- och p-underenheterna av luciferasenzym som katalyserar oxidationen av reducerad flavinmononukleotid (FMNH2) och en långkedjig fet aldehyd (R-CHO), genererad av LuxCDE-proteinerna. Detta resulterar i utsläpp av ett blågrönt ljus vid 490 nm. Eftersom biosensorbakterierna är naturligt mörka och inte kan producera AHQ, släpps ljus ut endast vid exponering för en exogen AHQ-källa.

Bild i full storlek

AHQ: er såsom PQS och HHQ kan detekteras i råcellfria kultursupernatanter med användning av den luxbaserade AHQ-biosensorn i en flytande mikrotiterplattanalys. Om AHQ-nivåerna är låga eller där information om cell- eller vesikelassocierade AHQ-er krävs, kan de helt enkelt koncentreras genom extraktion med lösningsmedel såsom diklormetan eller etylacetat, eftersom AHQs enkelt delas in i den organiska fasen. Efter avlägsnande av lösningsmedlet genom rotationsindunstning kan återstoden rehydratiseras i en vattenhaltig buffert före AHQ-biosensoranalys. Även om P. aeruginosa AHQ-bioreporter kan detektera HHQ och PQS vid nanomolära koncentrationer (detektionsgräns 12 nM för båda AHQ: er) svarar den på ett dosberoende sätt på båda föreningarna (MPF, SPD, S. Crusz, SR Chhabra, MC och PW, opublicerat manuskript). AHQ-biosensorn aktiveras mest känsligt av PQS och HHQ som båda har C7-alkylkedjor. Analoger med C5, C9 och C11 kan också aktivera biosensorn om än mindre känsligt (MPF, SPD, S. Crusz, SR Chhabra, MC och PW, opublicerat manuskript). Följaktligen återspeglar ljusutmatningen från bioreporteren som svar på en P. aeruginosa- kultursupernatant de kombinerade koncentrationerna av HHQ och PQS liksom de andra AHQ: er som anges ovan. De senare, åtminstone i P. aeruginosa , finns emellertid mestadels i väsentligt lägre koncentrationer förutom motsvarande C9-analoger, 2-nonyl-4-kinolon (HNQ) och 2-nonyl-3-hydroxi-4-kinolon (C9) -PQS) (se ref. 27). Den flytande AHQ-bioanalysen ger därför en positiv indikation för närvaron av PQS, HHQ och nära besläktade AHQ. Det är emellertid endast en halvkvantitativ indikation av de totala AHQ som finns i en given använt bakteriekultursupernatant. I P. aeruginosa , till exempel, kommer de erhållna data återspeglar huvudsakligen PQS- och HHQ-koncentrationerna. Analysen är emellertid helt kvantitativ om den används för bakterier, som endast utgör en enda AHQ och för syntetiska standarder. En typisk dos-responskurva för maximal ljusutgång från AHQ-biosensorn som svar på ett intervall av PQS- och HHQ-koncentrationer visas i figur 3. Vätskeanalysen är därför mycket lämplig där jämförande totala, snarare än absoluta, AHQ-koncentrationer för enskilda AHQ: er krävs. Vätskeanalysen kan inte tillhandahålla information om koncentrationerna av de individuella AHQ: er som finns i en blandning eftersom detta skulle kräva införande av ytterligare separations- och reningsteg genom exempelvis HPLC. En ytterligare begränsning av biosensorn är att den inte kommer att svara på alla AHQ-analoger även om detta kan betraktas som en stor fördel med avseende på HHQ- och PQS-analys.

Image

Dos-svarskurvor som visar ljuseffekten från AHQ-biosensorn (PAO1 pqsA CTX- lux :: pqsA ) som svar på ökande koncentrationer av ( a ) PQS och ( b ) HHQ. AHQ-biosensorn producerar ljus på exponering för AHQ på ett dosberoende sätt. Detektionsgränsen för PQS och HHQ är 12 nM för båda AHQ: er.

Bild i full storlek

För att bestämma huruvida både PQS och HHQ är närvarande tillsammans med andra AHQ, kan cellfritt supernatant-, cell- eller vesikel-extrakt extraheras med etylacetat och underkastas TLC. Efter kromatografi överläggs TLC-plattan med en tunn näringsämnesagar innehållande bioreporterstammen, som därefter övervakas med avseende på bioluminescens och pyocyaninproduktion (Fig. 4). Tentativ identifiering av positiva fläckar kan göras genom jämförelse av deras relativa migrationsvärden ( Rf ) med syntetiska standarder. En entydig kemisk identifiering av positiva föreningar kan göras genom MS och / eller NMR-analys. Metoden kan också göras mer kvantitativ genom att upptäcka ett intervall av koncentrationer av en syntetisk AHQ (er) på TLC-plattan.

Image

( a ) TLC-plattan körs med standarder för PQS och HHQ och supernatant-extrakt av PAO1, PAO1 pqsA och PAO1 pqsH och visualiserades under UV vid 312 nm. ( b ) Överläggning av TLC-plattan med mjuk toppagar innehållande biosensorbakterier som visar produktion av det gröna pigmentet, pyocyanin, som svar på AHQ: er, ( c ) Överlagring av TLC-plattan med mjuk toppagar innehållande biosensorbakterier som visar produktion av ljus som svar på AHQ: er visualiseras med en luminograffotonkamera. ( d ) Överläggning av TLC-plattan med mjuk toppagar innehållande biosensorbakterier som visar produktion av ljus som svar på AHQ: er visualiserade med användning av röntgenfilm exponerad för den överlagrade TLC-plattan under 5 minuter. TLC-körfält: ( 1 ): PQS 10 mM, 2 ul, ( 2 ): HHQ 10 mM, 2 ul, ( 3 ): PAO1 supernatant-extrakt, 5 ul, ( 4 ): PAO1 pqsA supernatant-extrakt, 5 ul, ( 5) ): PAO1 pqsH supernatant-extrakt, 5 ul. AHQ-biosensorn avger ljus över fläckar identifierade som PQS och HHQ i PAO1 och HHQ endast i PAO1 pqsH . Inga ljusfläckar observeras för den AHQ-negativa pqsA- mutanten. Platsen som migrerar under HHQ i spår 3 och 5 är primärt C9-analogen till HHQ, det vill säga HNQ.

Bild i full storlek

Alternativa AHQ-detekterings- och kvantifieringsanalyser

AHQ-biosensorn tillhandahåller ett enkelt, snabbt och känsligt sätt att detektera AHQ: er och i synnerhet PQS och HHQ utan att kräva någon sofistikerad instrumentering förutsatt att de är biologiskt aktiva. Definitiv kemisk analys kan uppnås med användning av omvänd fas högeffektiv vätskekromatografi (RP-HPLC) och vätskekromatografi (LC) -tandem masspektrometri 19, 20 . För RP-HPLC-analys av AHQ: er kan surgjorda etylacetat-extrakt av cellfria odlingssupernatanter elueras isokratiskt med användning av 80% (vol / vol) acetonitril i vatten som mobilfas och en omvänd fas C18-kolonn 19 eller med en linjär 30– 100% acetonitril / vattengradient plus 1% ättiksyra på en omvänd fas C8-kolonn 20 övervakning vid 240-250 nm. Samma betingelser kan användas för LC-MS / MS, och en omfattande masspektrometrisk analys av P. aeruginosa AHQ med användning av positiv elektrosprayjonisering presenteras av Lépine et al 20 . För kvantitativ PQS-analys har en stabil isotoputspädningsanalys beskrivits med användning av enkeljonövervakning kontra MS / MS i vilken deutererad PQS (5, 6, 7, 8-tetradeutero-2-heptyl-3-hydroxi-4-kinolon) används som en intern standard 27 . De metoder som beskrivs av Lépine et al . 20 är känsliga, kan ge definitiv kemisk identifiering och kvantifiering av individuella AHQ: er oberoende av deras biologiska aktivitet. De kräver emellertid tillgång till sofistikerad dyra instrumentering, som kräver specialistkompetens för att arbeta och tolka spektra, beror på tillgängligheten av den syntetiska deutererade PQS-standarden och kan vara mycket tidskrävande för ett stort antal prov.

tillämpningar

AHQ-biosensoranalyserna som beskrivs här kan användas för att detektera, tentativt identifiera och kvantifiera AHQ i bakteriekultursupernatanter och i vätskor eller på ytor förorenade med AHQ-producenter. Hittills har AHQ-producenter hittats i släkten Pseudomonas , Burkholderia och Alteromonas men är troligtvis mycket mer utbredda med tanke på närvaron av homologer av AHQ-biosyntetiska gener i andra gramnegativa bakterier 19 . Dessa analyser är mycket mottagliga för screening av ett stort antal miljömässiga och kliniska bakterieisolat för AHQ-produktion och kan konfigureras för användning som kliniska eller industriella diagnostiska verktyg. I TLC-konfigurationen kommer biosensoranalysen att ge information om AHQ-spektrumet, och både vätske- och TLC-analyser kan användas för att utvärdera påverkan av tillväxtbetingelser, till exempel biofilm-tillväxtläget eller specifika mutationer på AHQ-produktion. Biosensoranalysen kan också användas för att bekräfta den biologiska aktiviteten hos syntetisk PQS, HHQ och andra nära besläktade föreningar.

material

Reagens

  • Lager av bakteriestammarna som anges i tabellen nedan (tillgängliga från PW): alla bakterielagrar hålls vid -80 ° C i 25% (vol / vol) glycerol

    Stamma genotypFenotypkommentarer
    PAO1Föräldra stamAHQ-positiv kontroll
    PAO1 pqsA pqsA- mutant, som inte kan syntetisera några AHQ: erAHQ-negativ kontroll
    PAO1 pqsH pqsH- mutant, vilket gör HHQ och relaterade AHQ: er men inte PQS- eller PQS-analogerPQS-negativ, HHQ-positiv kontroll
    PAO1 pqsA CTX- lux ∷ pqsA pqsA- mutant innehållande en kopia av pqsA- promotorn länkad till luxCDABE- generna och insatt i ett neutralt ställe i kromosomenBiosensor för AHQ: er; AHQ negativt

  • PQS syntetisk standard 10 mM i metanol (PQS MW 259)

  • HHQ syntetisk standard 10 mM i metanol (HHQ MW 243)

  • PQS och HHQ kan syntetiseras såsom beskrivs av Pesci et al . 22 och av Diggle et al . 17 . Alternativt kan små mängder köpas från detta laboratorium

  • Baktotrypton (Becton, Dickinson och Co.)

  • Trypton (Oxoid)

  • Jästextrakt (Oxoid)

  • Agar teknisk nr. 3 (Oxoid)

  • Natriumklorid (Sigma)

  • Kaliumdihydrogenfosfat monobasic (KH 2 PO 4 ) (Sigma)

  • Tetracyklin, 50 mg ml-1 i metanol

  • Metanol, HPLC-kvalitet (Fisher Scientific)

  • Etylacetat, HPLC-kvalitet (Fisher Scientific)

  • Aceton, HPLC-kvalitet (Fisher Scientific)

  • Diklormetan, HPLC-kvalitet (Fisher Scientific)

  • Isättika, analytisk kvalitet (Fisher Scientific)

  • Luria-Bertani (LB) -medium: 1% (vikt / volym) baktotrypton, 0, 5% (vikt / vol) jästekstrakt, 1% (vikt / volym) natriumklorid i destillerat vatten

  • LB-agar: LB-media med tillsats av 2% (vikt / volym) agar-teknisk nr. 3

  • Mjuk toppagar: 0, 65% (vikt / volym) agar teknisk nr. 3, 1% (vikt / vol) trypton, 0, 5% (vikt / vol) natriumklorid

  • Kaliumdihydrogenfosfatlösning: 5% (vikt / volym) KH2PO4 i destillerat vatten

  • Syrat etylacetat: 0, 01% (vol / vol) isättika i etylacetat

Utrustning

  • -80 ° C frys

  • Skakande inkubator (t.ex. Innova 4000; New Brunswick Scientific)

  • Centrifug (t.ex. Avanti 30; Beckman)

  • Spektrofotometer (t.ex. Novaspec II; Pharmacia)

  • Rotationsindunstare (t.ex. R-114; Buchi)

  • -20 ° C frys

  • Hybridiseringsugn (Stuart Scientific)

  • UV-transilluminator (t.ex. Vilber Lourmat TFX-20.M, 312 nm)

  • Luminograf-fotonvideokamera (t.ex. LB 980; EG & G Berthold)

  • Röntgenfilm (t.ex. Pierce CL-Xposure 18 × 24 cm film)

  • 96-brunnars luminometer (Anthos Lucy1 eller Tecan GENios Pro)

  • 96-brunnars svarta, klara botten-mikrotiterplattor (Costar-Corning Inc.)

  • Rörluminometer (t.ex. EG&G Berthold Junior LB9509)

  • Luminometerrör (t.ex. EG&G Berthold Junior Tubes 12 × 75 mm)

  • Mikrovågsugn

  • bunsenbrännare

  • Bänk topp virvel

  • 250 ml Erlenmeyer-kolvar (steril)

  • Glasavskiljande trattar

  • 50 ml glasrundkolvar

  • Behållare för att hålla TLC-plattan för överläggning

  • Normal fas 20 × 20 cm kiseldioxid 60 F254 TLC-plattor (Merck)

  • TLC-utvecklingstank (Sigma-Aldrich, 27, 5 × 27, 5 × 7, 5 cm)

  • Universalbehållare (steril) (Bibby-Sterilin)

  • Centrifugrör (sterila) (konisk polypropen; BD)

  • Petriskålar (sterila) (Bibby-Sterilin)

  • 10 μl inokulationsslingor (steril) (SLS)

  • Autoklavband (t.ex. Comply; 3M)

  • Provflaskor 2 ml (SLS)

  • Engångsspruta (steril) (Terumo)

  • 0, 20 μm engångs sterila filter (t.ex. Minisart High Flow; Sartorius)

Procedur

Beredning av bakteriekulturer för AHQ-extraktion

Tidpunkt: 2 dagar

  1. Under sterila förhållanden sträcker man ut en 10 ul slinga av testbakterien (t.ex. P. aeruginosa PAO1) och kontrollstammarna (PAO1 pqsA (AHQ negativ) och PAO1 pqsH (HHQ positiv PQS negativ)) på färska LB-agarplattor. Växa över natten vid 37 ° C.

  2. Nästa dag, inokulera en enda koloni av varje stam i separata universella behållare, varvid varje universal innehåller 5 ml LB-medium. Odling över natt vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm Medan LB-medium används här kan andra näringsmedier ersättas om så önskas. Lämpliga antibiotika eller andra selektionsreagens kan sättas till tillväxtmediet efter behov för enskilda stammar.

  3. Bestäm den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600 ) av 1 ml av varje kultur över en natt och standardisera kulturerna till ungefär OD 1, 0 genom att spädas ut med färsk LB. Standardisering av kulturerna till OD 600 1.0 under specifika tillväxtförhållanden gör att kulturer kan jämföras direkt med varandra för AHQ-produktion. Om jämförbarhet mellan stammar inte är viktig kan standardisering av kulturer utelämnas för att spara tid.

  4. Överför aseptiskt 0, 25 ml av de standardiserade kulturerna till 25 ml LB-medium i en 250 ml Erlenmeyer-kolv. En liten kulturvolym i en stor kolv medger god luftning av mediet. Inkubera vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm under 8 timmar. Efter tillväxt, kontrollera OD 600 igen för att säkerställa att kulturerna har vuxit till en ekvivalent optisk densitet om jämförelse mellan stammar krävs. För att utföra mikrotiterplattanalysen, fortsätt enligt beskrivningen i ruta 1. Fortsätt med TLC-analysen, fortsätt med steg 5.

Beredning av bakteriekulturer

  1. Förbered råbakteriekultursupernatanter genom att odla testbakterien som beskrivs i steg 1–4 i huvudproceduren.

  2. Skörda 5 ml odling och snurra vid 10.000 g , 4 ° C i 5 minuter innan supernatanten samlas upp och förs genom ett sterilt Minisart (Sartorius) 0, 2 μm filter i rena rör.

    ▪ PAUSEPUNKT Detta supernatant-extrakt kan frysas i några dagar vid behov.

    Analys med 96-brunnars platta • TIMING 3 dagar

  3. Odla AHQ-biosensorn över natt, såsom beskrivs i steg 15 och 16 i huvudproceduren och späd ut med LB-medium till OD 600 1.0. Detta kan utföras under beredning av bakteriekulturer (steg 1 och 2) om det behövs för att spara tid.

  4. Vidare späds denna standardiserade biosensorkultur med LB-medium för att ge (a) 1 i 50 och (b) 1 i 100 utspädningar.

  5. Sterilisera en 96-brunnars platta, till exempel, under starkt UV-ljus i 15 minuter.

  6. För varje testbrunn, blanda 100 μl av testbakteriesupernatanten med 100 μl av 1 i 50-utspädning av biosensorn för att ge en slutlig odlingsutspädning på 1 i 100. För att separera negativa kontrollbrunnar, tillsätt 200 μl av 1 i 100 utspädning av AHQ-biosensorn ensam. Positiva kontrollbrunnar innehållande en 1 till 100-utspädning av biosensorn plus PQS- eller HHQ-standarden i en koncentration av 25 μM kan tillsättas eller alternativt 100 μl P. aeruginosa kultursupernatant (100 μl) plus 100 μl av 1 till 50-utspädningen av biosensorn kan också läggas till analysen. Förutom cellfria kultursupernatanter, kan de lösningsmedelsekstraherade kulturextrakten som beskrivits tidigare (steg 6–9 i huvudproceduren) också analyseras med denna metod. Späd helt enkelt 5 μl av lösningsmedelsekstraktet i 100 μl LB och tillsätt till 100 μl av 1 i 50 utspädning av AHQ-biosensorn per brunn.

  7. Övervaka bioluminescens och OD vid 37 ° C med hjälp av en kombinerad spektrofotometer / luminometer, till exempel Anthos LUCY1 kontrollerad av Stingray-programvaran (Dazdaq). Programmet mäter OD och bioluminescens från alla brunnar var 30: e minut i 24 timmar. Luminescens registreras som relativa ljusenheter (RLU) per enhet av OD. Om en automatiserad kombinerad spektrofotometer / luminometer inte är tillgänglig, kan avläsningar göras manuellt vid definierade tidpunkter genom att odla bakteriekulturerna under specifika förhållanden och mäta od och bioluminescens av odlingsprover med användning av en spektrofotometer och rörluminometer (t.ex. EG & G Junior) respektive.

• TIMING

Beredning av bakteriekulturer, steg 1 och 2: 2 dagar

Analys med 96-brunnar, steg 3–7: 3 dagar

AHQ-extraktion av bakteriekulturer

Tidpunkt: 5 tim

  1. Överför en definierad volym av varje kultur (i detta exempel 10 ml) till ett 50 ml centrifugrör och centrifugera vid 10 000 g , 4 ° C under 10 minuter.

  2. Extrahera cellerna (alternativ A) eller supernatanterna (alternativ B) beroende på om cellassocierade eller extracellulära AHQ: er analyseras. Det är möjligt att utföra båda alternativen samtidigt.

    1. Cell extraktion

      1. Dekantera supernatanterna (spara för supernatant-extrakt (alternativ B)) och resuspendera cellerna försiktigt i 10 ml färskt LB-medium.

      2. Centrifugera vid 10.000 g , 4 ° C under 10 minuter och kasta supernatanten. Upprepa tvättstegen (6A (i) och (ii)) för att ta bort alla spår av supernatanten från cellerna.

      3. Tillsätt 10 ml metanol till de resulterande cellpelletsen och virvel kraftigt tills de återsuspenderades.

      4. Låt stå i 10 minuter för att låta cellerna lysa innan de centrifugeras igen vid 10.000 g , 4 ° C under 10 minuter.

      5. Filtrera extraktet genom sterilt Minisart (Sartorius) 0, 2 μM filter i nya centrifugrör för att ta bort allt cellavfall från extraktionsblandningarna.

        Pauspunkt

        • Cellekstraktionsblandningar kan förvaras i frysen vid -20 ° C under flera dagar om det behövs.

    2. Supernatant extraktion

      1. Filtrera supernatanterna genom sterila Minisart (Sartorius) 0, 2 μM filter i rena centrifugrör för att ta bort eventuella icke-pelleterade celler från extraktionsblandningarna.

      2. Tillsätt 10 ml surgjord etylacetat till supernatanterna och virvla kraftigt under 30 s så att de två faserna blandas väl. Eftersom PQS är en järnchelator 17 surgörs etylacetatet för att frigöra metalljonen för att underlätta uppdelning av PQS i det organiska lösningsmedlet.

      3. Överför extraktionsblandningarna i två separerande tratt som tidigare har tvättats med aceton och låt extraktionsblandningarna sedimentera och de två faserna separeras.

      4. Överför de övre organiska skikten till rena centrifugrör. Upprepa steg 6B (ii) och (iii) på bottenlagren två gånger innan du kasserar. Poola de insamlade organiska skikten.

        Pauspunkt

        • Supernatant-extraktionsblandningar kan förvaras i frysen vid -20 ° C i flera dagar vid behov.

  3. Överför extraktionsblandningarna till 50 ml rundbottnade kolvar som tidigare har tvättats med aceton och rotationsindunstat blandningarna till torrhet.

  4. Tillsätt 0, 5 ml metanol till de rundkolviga kolvarna och omrör i 30 s innan du flyttar vätskan till 2 ml glasprovflaskor. Upprepa detta steg med ytterligare två tillsatser av 0, 5 ml metanol och poola varje prov i varje injektionsflaska.

    Pauspunkt

    • Cell- och supernatant-extraktionsblandningar kan förvaras i frysen vid -20 ° C i flera dagar vid behov.

  5. Torka ner extraktionsblandningarna i provflaskorna under en ström av kvävgas. Förvara proverna i frysen vid -20 ° C tills de behövs.

    Pauspunkt

    • Torra celler och supernatant extraktionsrester kan förvaras i frysen vid -20 ° C i flera månader om det behövs.

Beredning av TLC-plattor och körning av prover

Tidpunkt: 3 timmar

  1. Beredning av normalfas-kiseldioxid 20 × 20 cm 60 F254 TLC-plattor genom blötläggning i en 5% (vikt / volym) lösning av KH2PO4 i 30 minuter innan den aktiveras vid 100 ° C under 1 timme. En hybridiseringsugn kan användas för att göra detta.

    Pauspunkt

    • TLC-plattorna är nu klara för användning och kan förvaras i flera veckor om de hålls rena, torra och vid rumstemperatur (20–22 ° C).

    Kritiskt steg

    • Beredning av biosensorkulturen (steg 15 och 16) kan startas samtidigt som testbakterien, dvs 2 dagar innan TLC-plattan körs.

  2. Rita en svag linje i penna ungefär 4 cm från botten av den aktiverade kiseldioxid-TLC-plattan; detta kommer att användas som en guide för att upptäcka provekstrakter.

  3. Beräkna provekstrakter (från steg 9) i 100 ul metanol och placera 5 mikroliter av var och en på TLC-plattan. Mängden extrakt som ska upptäckas kan ändras efter önskemål. Som positiva kontroller kan 2 ul av 10 mM stamlösningar av syntetiska PQS och HHQ (eller andra AHQ) i metanol upptäckas på TLC-plattan. Placera varje plats med intervaller på 2 cm längs linjen och valfritt kan en hårtork användas för att torka prover under fläckning för att ge en stramare plats.

  4. När det är torrt placerar du TLC-plattan i en utvecklingsbehållare och kör TLC med en blandning av diklormetan: metanol (95: 5) som mobilfas tills lösningsmedelsfronten är 1–2 cm från toppen av plattan. TLC-plattan kan visualiseras med hjälp av en UV-transilluminator vid 312 nm och fotograferas vid denna punkt.

  5. Låt TLC-plattan torka och applicera autoklavtejp på både undersidan av TLC-plattan och runt kanterna så att tejpen skapar en brunn som är minst 0, 5 cm djup runt TLC-plattan i vilken näringsagaren som innehåller biosensorn hälls. Se till att autoklavtejpen är ordentligt pressad ner och bildar en tät tätning. Denna procedur beskrivs steg för steg i figur 5.

    Pauspunkt

    • TLC-plattan kan förvaras vid rumstemperatur (20–22 ° C) på en torr plats i upp till en vecka

Image

( a ) Fäst en remsa autoklavtejp på aluminiumstödet längs varje kant av TLC-plattan och tryck ner ordentligt för att säkerställa en god tätning. ( b ) Trimma överskottet autoklaveband med hjälp av sax. ( c ) Kläm in autoklavtejpen vid varje hörn av TLC-plattan, skapa en barriär av autoklavtejp längs varje sida av TLC-plattan, som visas för hörnen (1) och (2) för att skapa en brunn. ( d ) Placera TLC-plattan framställd som visas i c i en lämplig skål och häll i brunnen den smälta mjuka toppagaren som innehåller biosensorbakterierna.

Bild i full storlek

Övertäckning av TLC-plattor med AHQ-reportern

Tidpunkt: 2 dagar

  1. Med hjälp av aseptisk teknik sträcker du ut en 10 μl slinga av AHQ-biosensorn (PAO1 pqsA CTX- lux ∷ pqsA ) på färska LB-agarplattor som innehåller 125 μg ml −1 tetracyklin och växer över natten vid 37 ° C.

  2. Nästa dag, inokulera en enda koloni i en universalbehållare som innehåller 5 ml LB-medium och växa över natten vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm

    Kritiskt steg

    • Steg 15 och 16 kan utföras innan du kör TLC-plattan om det behövs för att spara tid.

  3. Nästa dag smälter 100 ml mjuk toppagar i en mikrovågsugn och låt svalna till ∼ 50 ° C. Tillsätt 1 ml av kulturen över natten till den mjuka toppagaren och blanda försiktigt.

    Kritiskt steg

    • Se till att agaren har svalnat tillräckligt innan du tillsätter reporterbakterierna. För hög temperatur kommer att skada eller döda bakterierna och dämpa tillväxten. En temperatur på 50 ° C möjliggör enkel hällning av agar och ger tillräcklig tid att hälla plattan innan agaren sätts.

  4. Häll blandningen långsamt i brunnen framställda runt TLC-plattan, var noga med att minimera bubbelbildningen i agaren och på TLC-plattan.

    Kritiskt steg

    • Försena inte för länge annars kommer agaren att stelna innan den hälls. Om det bildas bubblor kan dessa antingen omröras till plattans kant innan agaren sätts eller en Bunsen-brännare kan användas för att (försiktigt!) Låga ytan på agaren för att ta bort dem.

    Felsökning

  5. Låt agaren svalna och läggas aseptiskt runt en Bunsen-låga före statisk inkubation vid 37 ° C under 6 timmar för att se ljusproduktion, eller över natten för att se pyocyaninproduktion.

  6. Visualisera plattorna för ljusproduktion med en luminograffotonvideokamera eller utveckla med röntgenfilm (t.ex. Pierce CL-XPosure-film). Alternativt kan du bara se produktionen av det blå / gröna fenazinpigmentet pyocyanin med ögat. Resultaten av denna procedur visas i figur 4.

    Felsökning

Felsökning

Felsökningsråd finns i tabell 1.

Full storlek bord

timing

Förbereda bakteriekulturer för AHQ-extraktion, steg 1-4: 2 dagar

AHQ-extraktion av bakteriekulturer, steg 5–9: 5 timmar

Beredning av TLC-plattor och provkörning, steg 10–14: 3 h. Stegen 15 och 16 kan utföras före steg 10–14.

Överläggning av TLC-plattor med AHQ-reportern, steg 15–20: 2 dagar (för att se ljuseffekt) eller 3 dagar (för att se pyocyaninproduktion)

Kom ihåg att en väsentlig del av de angivna tiderna för båda analyserna involverar "vilande" perioder, till exempel för tillväxt av kulturer, drift av TLC: er, etc. Den faktiska arbetsbelastningen som är inblandad är mycket mindre än den som antyds av den totala tidsramen.

Förväntade resultat

TLC-analys

TLC-biosensoranalysen, när den är kopplad med syntetiska standarder, indikerar närvaron eller frånvaron av AHQ-molekylerna såsom PQS och HHQ i ett prov framställt av P. aeruginosa . För AHQ: er som produceras av andra bakterier är ett positivt svar från biosensorn för en plats med ett givet Rf- värde en tentativ indikation på närvaron av en AHQ, och ytterligare MS- eller NMR-analys krävs för att entydigt identifiera AHQ. I exemplet som visas i figur 4 extraherades kulturer av PAO1, den AHQ-negativa pqsA- mutanten av PAO1 och den PQS-negativa, HHQ-positiva pqsH- mutanten för AHQ, extrakten kördes på TLC och överlagdes sedan med agar innehållande AHQ-biosensorn bakterie. PAO1 är en stam av P. aeruginosa av vildtyp och producerar ett omfattande intervall av AHQ-molekyler inklusive både PQS och HHQ medan pqsA- mutanten är bristfällig för AHQ-biosyntes. AHQ-kultursupernatant-extrakten, körs på TLC och jämförs med PQS- och HHQ-standarder och visualiseras under UV-ljus, visas i figur 4a. Med denna metod, under UV-ljus (312 nm), fluorescerar den syntetiska PQS-standarden rosa och har ett större Rf- värde än den lila HHQ-standarden eftersom den är mer polär och går längre upp på plattan. Dessa fläckar finns i PAO1-extraktet men inte i PAO1 pqsA- extraktet. Bekräftelse av att dessa fläckar är PQS och HHQ visas när plattorna är överlagda med bioreporteren tillsammans med PQS och HHQ syntetiska standarder. Reporterbakterierna producerar ljus som svar på PQS och HHQ på plattan över respektive standard, och även över motsvarande fläckar från PAO1-supernatantprovsextrakten. Reporterbakterierna svarar bara på AHQ: er; därför finns det inga ljusfläckar över provekstrakten från PAO1 pqsA- mutanten. PqsH- mutanten visar främst en plats motsvarande HHQ. Platsen som löper under HHQ i både cell- och supernatant-extrakt är en blandning av HHQ-relaterade molekyler inklusive HNQ och N-oxidderivatet av HHQ (2-heptyl-4-kinolon- N- oxid), som inte helt löser detta TLC och finns också i P. aeruginosa supernatanter 21 . Observera att det finns ett större svar på HHQ än PQS, vilket kan vara en följd av starkare interaktioner mellan PQS och den kiselsatta stationära fasen, eftersom den senare är en stark metalljonkelator 17 . Pyocyaninproduktion av biosensorn följer ett liknande mönster som ljusproduktion. Om så önskas kan slutlig identifiering av AHQ: er som detekteras via denna TLC-analys därefter uppnås med användning av MS eller NMR-tekniker.

Mikroplattanalys

Den flytande AHQ-biosensoranalysen kommer att ge ett kumulativt svar på alla biologiskt aktiva AHQS i ett odlingsprov. Figur 6 visar den genomsnittliga maximala ljusutgången från cellfria odlingssupernatanter framställda från PAO1 respektive PAOl pqsA- mutanten före respektive efter extraktion med etylacetat. Reporterbakterierna svarar bara på AHQ: er; därför finns det endast utgångsljusutgång från de koncentrerade supernatant-extrakten av PAO1 pqsA- mutanten och negativ kontroll (endast bioreporter). PAO1-proverna framkallar båda en stor ökning av bioluminescens av bioreporteren, vilket bekräftar närvaron av AHQ-molekyler i provet och ger en indikation på deras jämförande kumulativa nivåer.

Image

Genomsnittlig maximal ljusutgång från AHQ-biosensorn i frånvaro eller närvaro av cellfria odlingssupernatanter (råa eller koncentrerade etylacetat-extrakt) framställda från PAO1 respektive pqsA- mutanten (negativ kontroll). Biosensorn avger ljus som svar på PAO1 men inte pqsA-kultursupernatanten .

Bild i full storlek

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.