Bh3-svarsprofiler från neuroblastom mitokondrier förutsäger aktivitet av små molekyler bcl-2-familjantagonister | celldöd & differentiering

Bh3-svarsprofiler från neuroblastom mitokondrier förutsäger aktivitet av små molekyler bcl-2-familjantagonister | celldöd & differentiering

Anonim

Abstrakt

Bcl-2-familjeproteiner reglerar mitokondriell apoptos nedströms olika stressfaktorer. Cancerceller avreglerar ofta Bcl-2-proteiner vilket leder till kemoresistens. Vi har optimerat en plattform för solida tumörer där Bcl-2-familjens resistensmönster sluts. Funktionella mitokondrier isolerades från neuroblastom (NB) -cellinjer, exponerades för distinkta BH3-domänpeptider och analyserades för cytokrom c- frisättning. Sådana BH3-profiler avslöjade tre mönster av cytokrom c- svar. En undergrupp hade ett dominerande NoxaBH3-svar som antydde Mcl1-beroende. Dessa celler var mer känsliga för små molekyler som antagoniserar Mcl1 (AT-101) än de som antagoniserar Bcl-2, Bcl-xL och Bcl-w (ABT-737). En andra undergrupp hade ett dominerande BikBH3-svar, vilket antydde ett Bcl-xL / -w-beroende och var utsökt känsligt för ABT-737 (IC 50 <200 nM). Slutligen var de flesta NB-cellinjer härledda vid återfall, relativt resistenta mot pro-death BH3-peptider och Bcl-2-antagonister. Våra resultat definierar heterogenitet för apoptosresistens hos NB, hjälper till att triage framväxande Bcl-2-antagonister för klinisk användning och ger en plattform för studier för att karakterisera resistensmekanismer efter terapi för NB och andra solida tumörer.

Huvudsaklig

Bcl-2-familjen av proteiner reglerar mitokondriell apoptos. Specifika cellulära stressfaktorer, inklusive de som initieras av kemo- och strålterapi, aktiverar utvalda BH3-proteiner endast för död genom olika transkriptionella eller translationella mekanismer. 1 Efter aktivering är dessa proteiner fritt att interagera med Bcl-2-familjemedlemmar med flera domäner bosatta vid det yttre mitokondriella membranet. Här kan en delmängd av BH3-bara proteiner direkt aktivera de obligatoriska exekveringarna Bak eller Bax, vilket inducerar oligomerisering och cytokrom c- frisättning, och begår cellen till döds. BH3-endast proteiner med denna kapacitet har benämnts "aktivator" BH3 och inkluderar Bid och Bim. Alternativt kan de sekvesteras i den hydrofoba fickan av proöverlevnadsproteiner såsom Mcll, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w och Al / Bfl, vilket neutraliserar deras dödsignal. Andra BH3-endast proteiner (såsom Noxa, Bik, Bad och andra) verkar oförmögen att direkt aktivera Bak / Bax-aktivering men möjliggör indirekt apoptos. Denna "möjliggörande" -funktion har på olika sätt tillskrivits en högre affinitet för pro-survival-fickor som orsakar förskjutning av sekesterade aktivator BH3 eller till förskjutning av pro-survival Bcl-2-proteiner från direkt Bak / Bax-repression. I båda fallen bestämmer stökiometri och funktionellt tillstånd hos Bcl-2-familjemedlemmar om en apoptotisk signal överförs.

Distinkta vävnader uttrycker heterogent Bcl-2-proteiner, vilket tillåter vävnadsspecifika svar på påträffade stressorer. Avvikande Bcl-2-familjeuttryck kan också åtföljas av tumörprogression som ytterligare bidrar till tumörspecifik variation i dessa vägar. Exempelvis överuttrycker hematopoeitiska maligniteter ofta en enda Bcl-2-medlem för överlevnad och är utsökt känsliga för dess selektiva antagonism. 2, 3, 4, 5 Dessa maligniteter svarar faktiskt ofta på flera återvinningsbehandlingar efter återfall. Däremot är solida tumörer i allmänhet mer apoptosresistenta, vanligtvis misslyckande frontlinje- och / eller räddningsterapi på grund av deras förmåga att dämpa apoptotisk signalering. 6 Det är därför motiverat att ytterligare undersöka mekanismerna för undvikande av apoptos för solida tumörer.

Syntetiska peptider som består av BH3-domäner från endast BH3-proteiner kan användas som bioprober för att bedöma mitokondriella svar på dödsstimuli. 7, 8, 9, 10 Genom att profilera isolerade cancercellmytokondrier för cytokrom c- frisättning efter exponering för en mångfaldig panel av BH3-peptider som har distinkta affiniteter för Bcl-2 pro-survival proteiner, Certo et al. 7 identifierade mönster för överlevnadsberoende i en modell av leukemi som skilde sig från normala hematopoeitiska vävnader. BH3-profilering användes för att definiera resistensmekanismer i dessa cancerformer och avslöjade Bcl-2-beroende för ALL, CLL och vissa lymfom. 2, 3, 4 BH3-profilering har varken tillämpats på solida tumörundersökningar eller någon pediatrisk tumör hittills. Neuroblastoma (NB) är en mycket letal pediatrisk fast tumör härrörande från att utveckla sympatiska neuroblaster. Anmälningar kräver intakt mitokondriell apoptos för kemoterapiinducerad celldöd. 11, 12 Undvikande av apoptos bidrar till dess aggressiva fenotyp 13 och patienter buknar ofta för kemoresistant sjukdom. 11 Vi försökte därför definiera de huvudsakliga mönstren för apoptosrespons och resistens i NB med hjälp av en opartisk funktionell mitokondriabaserad analys.

Vi optimerade en BH3-profileringsmetod för fasta tumörer och visar att tillräcklig funktionell mitokondrier kan samlas in från vidhäftande cellinjer eller nyligen erhållna xenografter. OBS: mitokondrier svarar på olika BH3-domäner med cytokrom c- frisättning i mycket reproducerbara mönster (kallas en BH3-svarprofil). Dessa mönster skiljer sig från icke-maligna celler som inte svarar på möjliga BH3-peptider, vilket stödjer ett grundat för dödstillstånd i NB. Vidare visas bevis för Bcl-2-pro-survival proteinredundans och heterogenitet inom denna enstaka cancer typ. Åtminstone tre distinkta mönster identifierades, vilket möjliggjorde att det dominerande pro-överlevnadsberoendet kan dras. Slutligen var mitokondriella BH3-svarsprofiler starkt korrelerade med och förutsägbara hela cellresponser på små molekyl Bcl-2-familjantagonister. Våra data antyder att BH3-profiler tillförlitligt fångar den Bcl-2 familjestyrda apoptotiska börvärdet för dessa tumörer. Dessa studier belyser nyckelvägar för apoptosundvikelse i NB och kan användas för att definiera surrogatbiomarkörer för att triage små molekyler Bcl-2-antagonister. De ger också en plattform för mekanistiska studier för att karakterisera terapiresistens hos denna tumörtyp.

Resultat

BH3-svarsprofiler avslöjar tydliga pro-survival-beroendemönster i neuroblastom

Vi isolerade mitokondrier från 10 olika tumör-härledda NB-cellinjer som representerar högrisksjukdom. Mitokondrier exponerades för mättande koncentrationer av BH3-domänpeptider och bedömdes för cytokrom c- frisättning som en markör för mitokondriell yttre membranpermeabilitet (MOMP) och apoptos. Testpeptider omfattade de a- heliska dödsdomänerna och, baserat på tidigare studier, bibehåller selektiv affinitet för pro-survival BH-fickor. Därför definierar BH3-svarsprofilen tumörcellens börvärde för transduktion av BH3-medierad dödsstimuli. Exempelvis antyder cytokrom c- frisättning som svar på NoxaBH3 ett Mcl1-överlevnadsberoende, eftersom Mcl1-aktiviteten ensam neutraliseras av NoxaBH3. Tabell 1 sammanfattar tidigare bestämda BH3-peptid / pro-survival-affiniteter. Sådana tillhörigheter är i stort sett överensstämmande på olika sätt. 7, 14

Full storlek bord

Alla NB-härledda mitokondrier släppte cytokrom c som svar på rekombinant tBid (positiv kontroll), BidBH3 och BimBH3-peptider (figur 1). Cytokrom c- frisättning som svar på sådana "aktivator" -peptider bekräftar intakt Bak / Bax-signaltransduktion, och med få undantag (se SK-N-AS) var denna frisättning robust. Däremot var den substituerade BidaltBH3-peptiden inaktiv mot alla cellinje-mitokondrier. BH3-peptidsvar var reproducerbara i replikatförsök eftersom rangordningens styrka för peptiderna bibehölls (med undantag av BmfBH3), vilket återspeglade en specifik funktionell avläsning. Cytokrom c- frisättning till åtminstone en delmängd av möjliga peptider (t.ex. Bik, Noxa, Bmf) hittades i majoriteten av de testade NB: erna, vilket antyder att dessa mitokondrier hamnar endogena aktivator BH3-signaler som är toniskt undertryckta. Vidare framkallade inga möjliga BH3-peptider cytokrom c från icke-transformerade neurala RPE1-celler eller humana T-celler (figur 1c).

Image

BH3-svarsprofilering definierar tre distinkta beroende-överlevnadsmissbrukmönster i NB. Funktionella mitokondrier exponerades för en mättande koncentration av enskilda BH3-endast dödsdomänspeptider och analyserades med ELISA immunanalys för cytokrom c- frisättning. Grå staplar, förmodad aktivator BH3-peptider; svarta staplar, möjliggör BH3-peptider med selektiv bindning till pro-survival-proteiner; se tabell 1. BH3-svarsprofiler visade en dominerande Noxa-inducerad cytokrom c- frisättningsgrupp ( a ), en dominerande Bik-inducerad cytokrom c- frisättningsgrupp ( b ) och tumörceller relativt resistenta mot möjliggörande peptider ( c ). Den senare gruppen är berikad för cellinjer etablerade vid återfall. Kontroll RPE-1 och T-cell mitokondriella svar visas också. Genomsnittliga och standardavvikelser för minst två biologiska och tekniska replikat visas. Rangordningens responsivitet för peptider var identisk mellan oberoende experiment. hTceller, humana T-lymfocyter; μM , mikromolär; BH3-endast proteinnamn representerar BH3-domänpeptiden från det proteinet; Tbid, rekombinant avkortat Bid-protein; Bidalt, ersatt BidBH3-domän för att upphäva Bcl-2-familjinteraktioner

Bild i full storlek

Eftersom BH3-peptider har redundanta bindande affiniteter för Bcl-2-medlemmar valde vi att bedöma hela repertoaren för BH3-svar som en indikation på mitokondriell signalutgångspunkt. Vi utförde därför hierarkisk gruppering för att karakterisera dessa svarmönster. Clustering genomfördes initialt både med alla peptidsvar inkluderade ( n = 9 peptider) såväl som Bmf ( n = 8 peptider). Vi resonerade att den fysiokemiska stressen av vidhäftande celluppsamling kan leda till aktivering av endogen Bmf, en nyckelman av anoikis. 15 Vi noterade också att Bmf-medierad cytokrom c- frisättning var mycket mer varierande mellan biologiska replikat jämfört med andra peptider. Kluster av BH3-svarsprofiler från NB-mitokondrier identifierade tre dominerande klädor, eller BH3-svarsklasser (figur 2a). Båda klusteranalyserna (inklusive eller utelämnande av Bmf) var nästan identiska med endast en celllinje (LAN5) -skiftande kluster i denna jämförelse. Vidare visade bedömningen av dendrogrammen att det mesta av informativiteten vid klustering härstammade från differentierade svar på NoxaBH3 och BikBH3, eftersom rekluttering med endast dessa två peptider rekapitulerade exakt samma clade-inkludering som 8-peptidanalysen (figur 2a; data visas inte) .

Image

( a ) Hierarkisk klusteranalys av NB-cellinjer och xenografter baserade på BH3-profiler avslöjar tre distinkta svarmönster. Skuggade kladder avgränsar de tre svarsklyngarna på de två mest dominerande möjliga peptiderna, Noxa och Bik. 'SK-N-AS- (POST VP-16)' representerar BH3-profilen för SK-N-AS efter sublethal etoposidbehandling. 'XG', xenograft, profiler visar alla utom ett NB xenograft sammansatt med dess överordnade monolagscellrespons. ( b ) Xenograft- och monolagskultur BH3-profiler visar konkordans. Icke-nekrotiska xenograft-tumörer <500 mm 3 uppsamlades från flankerna hos immunbristmöss. Tumörer halverades med en sektion demonterad och pläterades för att upprätta en monolagercellinje för mitokondriell BH3-svarprofilering (monolager; vänsterpaneler). Den andra sektionen användes omedelbart för att isolera den tunga membranfraktionen innehållande funktionell mitokondriell för Xenograft BH3-svarprofilering (högerpaneler). Felstänger representerar medelvärdet och standardavvikelserna för minst två separata experiment

Bild i full storlek

NB-celler från samma kluster visade liknande BH3-svarmönster (figur 1 och 2). De mest potenta möjliga peptiderna för varje klass kunde visuellt bestämmas och statistiskt valideras. Vi jämförde cytokrom c- frisättning medierad av varje aktiverande BH3-peptid med frisättning medierad av aktivatorn BH3-peptider (tBid, Bim eller Bid) för varje cellinje. Enabler-peptider med cytokrom c- frisättning som överskred den negativa kontrollen (BidAltBH3) och som statistiskt inte kunde skiljas från svar på aktivator BH3 eller tBid ansågs som robusta frigörare (t.ex. NoxaBH3 i IMR5; figur 1a). Peptider med cytokrom c frisätter mellanprodukt mellan den positiva kontrollen och den negativa kontrollen ansågs aktiva men mindre potent (t.ex. BikBH3 i IMR5); och de som statistiskt inte kan skiljas från den negativa kontrollen var icke-aktiva. Detta gjorde det möjligt för oss att dra slutsatsen om pro-survival Bcl-2-proteinberoende bland dessa klasser.

Det första klustret (som inkluderar IMR5, NLF och 902R) visade den mest robusta cytokrom c- frisättningen med NoxaBH3 (kallad Noxa-dominant), vilket stödde ett Mcl1-överlevnadsberoende (figur 1a). Noxa-inducerad cytokrom c- frisättning för dessa celler kunde inte skiljas från direkta aktivatorpeptider tBid, BidBH3 och BimBH3 ( P > 0, 20 för varje), vilket tyder på robust frisättning. Dessa celler hade vanligtvis också ett påvisbart svar på BikBH3, vilket antydde ett potentiellt samberoende av antingen Bcl-xL eller Bcl-w, även om detta svar var mindre robust (minskat jämfört med positiv kontrollfrisättning; P <0, 05). Ett beroende av Bcl-2 är mindre troligt eftersom BadBH3 inte inducerade signifikant frisättning av cytokrom c . Emellertid har BikBH3 också blygsam Mcl1-affinitet, vilket kan förklara dess effekt vid de höga studerade koncentrationerna (tabell 1). Sammantaget stöder profilen ett dominerande Mcl1-beroendemönster och förutsäger terapier som motverkar Mcl1 kan öka celldöd i dessa celler.

Det andra klustret inkluderade LAN5, SMS-SAN, SMS-KCN och NB1643. Mitokondrier från dessa celler var mest känsliga för BikBH3 (kallad Bik-dominerande) (figurerna Ib och 2). NoxaBH3-svar fanns i dessa cellinjer men mindre robusta ( P <0, 01 jämfört med positiva kontroller). Förutom LAN5 utlöste BmfBH3 också cytokrom c- frisättning i överensstämmelse med dess liknande Bcl-2-familjeaffiniteter (tabell 1). Alla utom SMS-SAN svarade inte på BadBH3, vilket tyder på att Bcl-2 inte är den främsta överlevnadsmedlaren utan föreslog ett Bcl-xL- eller Bcl-w-beroende. Dessa celler förutsägs vara känsliga för Bcl-2 / Bcl-xL / Bcl-w-antagonister såsom ABT-737.

Det tredje klustret kännetecknades av relativ resistens mot alla möjliga BH3-peptider (representerade av CHP134, SK-N-AS och BE2C; se figurerna 1c och 2). I den hierarkiska klusteringen var den största skillnaden i svarsprofiler mellan denna delmängd av möjliggörande celler och de andra två grupperna (figur 2a). SK-N-AS-celler hade också konsekvent försvagade svar på aktivator BH3-peptider och kan ha resistensmekanismer på plats nedströms Bcl-2-signalering. Alla resistenta cellinjer uttryckte Bak- och Bax-protein (figur 4) även vid mitokondrierna (från isolerade mitokondrierimmunblott; data visas inte), vilket antyder att de inte är grundade för apoptos. Noterbart var alla sådana BH3-resistenta NB-cellinjer härledda från tumörer erhållna vid återfall efter cytotoxiska terapier. Detta överensstämmer med den extrema terapimotstånd som ses kliniskt efter återfall efter hög riskterapi, som är enhetligt dödlig.

Image

Proteinuttrycksmönster för Bcl-2-familjeproteiner med flera domäner i NB. ( a ) NB-celler som växte i fyllda medier vid stabilt tillstånd samlades och immunblottades för proteiner. P- tubulin fungerade som belastningskontroll. * Celler med en Bik-dominerande BH3-profil. ( b ) Histogram som representerar Bcl-2-familjeproteinimmunbloter normaliserade till p- tubulinbelastningskontroll

Bild i full storlek

Neurala RPE1-celler och T-celler är icke-transformerade och visar en brist på möjliga BH3-svar (figur 1c). Bax / Bak-signalering var intakt, eftersom deras mitokondrier släppte cytokrom c som svar på BimBH3 (dock i mindre grad än cancer-härledda mitokondrier) som potentiellt återspeglar skillnader i Bax och / eller Bak pre-aktivering. Sammantaget förstärker motståndet för sådana normala celler mot möjliga BH3-peptider föreställningen att NB-celler är mer beroende av apoptosundertryckning, vilket ger ett potentiellt terapeutiskt fönster för medel som motverkar pro-överlevnad Bcl-2-familjefunktioner.

Tumorbildning in vivo förändrar inte BH3-svarsprofiler

Det är möjligt att artifaktuell priming med endogena aktivator BH3-proteiner sker med cellhantering och inte återspeglar cancerens inneboende apoptotiska signalstatus. Att icke-transformerade celler inte svarade på möjliga BH3-peptider var lugnande, särskilt eftersom RPE1-celler är vidhäftande och också genomgick mekanisk och kemisk (versene) cytoskeletalsspänning under insamling. Vi försökte bestämma om cell- / cell-ledtrådar som finns i tredimensionella tumörstrukturer och inkluderar heterotypiska celler kan förändra svarsprofiler. Överlevnadssignaler som finns i mikromiljön kan förhindra frisättning av cytokrom c genom att undertrycka endogen BH3-proteinaktivering. Vi erhöll BH3-svarsprofiler från mitokondrier samlade direkt från färska xenografts för tre NB-cellinjer. Xenograft-mitokondriella svar skilde sig inte kvalitativt från de som erhölls under monolagerbetingelser (figur 2b). Även om frisättning av xenograft cytokrom c marginellt avstängdes i jämförelse med monolagsresultat, var rangordningens responsivitet över peptider identisk i alla tre cellinjerna. Hierarkisk klustering placerade både SK-N-AS och SMS-SAN xenografter i samma klass som deras monolags svar, medan NB-1643 placerades i den BH3-resistenta klassen (figur 2a). Att xenografterna bibehöll relativt robusta möjliga BH3-peptidrespons (se SMS-SAN) minskar sannolikheten för att dess grundade status in vitro uppstår enbart på grund av frigöring av underlag. Dessa studier visar viktigt även genomförbarheten av att erhålla BH3-svarsprofiler från nyligen isolerat tumörmaterial.

BH3-peptidrespons verkar genom genetiskt definierade roller för BH3-proteiner i den inre apoptosvägen

BH3-peptidkoncentrationer som används för cytokrom c- frisättningsanalyser är tillräckliga för att mätta Bcl-2-proteinbindningsställen och främja konkurrenskraftig förskjutning av aktivator BH3-proteiner. För att testa detta utsatte vi mitokondrier för minskande koncentrationer av både aktiverande och aktivator BH3-peptider, Bik, Noxa och Bim (se LAN5, figur 3a). Dessa resultat stöder mättnad eftersom högre koncentrationer resulterar i en platå i cytokrom c- frisättning. Dessa resultat överensstämmer också med skillnaden mellan aktivator- och aktiveringseffekter av BH3. Minimal Bim-exponering inducerad cytokrom c- frisättning (1 μM ), antagligen genom direkt interaktion med Bax / Bak, och 5 μM var fullt aktiv (jämfört med tBid). Däremot krävdes högre Bik- och Noxa-peptidkoncentrationer för att inducera en liknande grad av frisättning av cytokrom c och effekten platå vid 25 mikrometer. Vidare svarade Bcl-xL / -w-beroende cellinjer (t.ex. LAN5, Bik-dominerande) till Bik vid 1 μM och robust vid 5 μM , medan högre Noxa-koncentrationer krävdes. Detta överensstämmer med olika styrka på grund av selektiva pro-survival-affiniteter. Eftersom våra resultat tyder på att priming för celldöd har inträffat i många NB-celler vid stabil tillstånd, sökte vi bevis för tonisk förtryck av aktivator BH3-proteiner. Samimmunutfällningsförsök visade att Bim, men inte Bad, Puma, tBid eller Bak, skulle vara bundna till Mcl1, Bcl-xL och Bcl-2, vilket ytterligare stödjer teorin om att de innehar endogena aktivator BH3-proteiner sekvenserade till pro-survival-medlemmar för att förhindra apoptos (figur 3b).

Image

Funktionell validering av BH3-peptidaktivitet. ( a ) Dosberoende svar från LAN5-mitokondrier på BH3-peptider BimBH3, BikBH3 och NoxaBH3 som visar förbättrad känslighet för aktivator (Bim) -peptider och visar högre styrka för Bik över Noxa i denna Bik-dominerande NB. ( b ) Samimmunutfällningsdata bekräftar att NB: er är grundade för döden eftersom endogent aktiverat BH3-protein Bim är bundet till Mcl1, Bcl-2 och Bcl-xL vid stabil tillstånd. Reverse pull down, P- tubulin IP, och pärlbanan bekräftar att dessa är verkliga BH-proteininteraktioner. Bim-EL, 'Extra lång' Bim-isoform; Bim-L, 'Long' isoform. ( c ) SK-N-AS visar förändring i BH3-profil till ett Noxa-dominerande mönster efter exponering för sublethala doser av etoposid, identifierande Mcl1 som möjligt bidragande till etoposidresistens i denna cellinje; 2 × 108 celler exponerades för 10 μg / ml etoposid, sedan tvättades cellerna och samlades upp, mitokondrier isolerades och exponerades omedelbart för panelen BH3-peptider för att utvärdera cytokrom c- frisättning

Bild i full storlek

Därefter försökte vi bestämma om en celllinje frånvarande påvisbar priming för döden kunde bli grundad efter cytotoxisk läkemedelseksponering. Etoposid har visat sig aktivera Bim för att inducera apoptos. 16 SK-N-AS-celler, etablerade vid återfall efter kemoterapi, är resistenta mot etoposid (IC50 med MTT> 150 μg / ml). De kluster med andra "resistenta" NB-cellinjer baserade på BH3-svarsprofiler (figur 3c). Vi förbehandlade SK-N-AS-celler med en sublethal etoposid-exponering (10 μg / ml) och bedömde BH3-svar (figur 3c). Tidigare ineffektiva peptider, Noxa och Bik, inducerade mer kraftigt cytokrom c efter exponering för etoposid vid> 1 log mindre än IC 50 . Detta antyder att pro-survival Bcl-2-proteiner såsom Mcl1 grundas med endogen aktivator BH3-endast protein nedströms denna stressstimul. I överensstämmelse med denna upprepade hierarkiska klusteranalyser tilldelade SK-N-AS efter etoposidbehandling till den Noxa-dominerande gruppen (figur 2a).

Pro-överlevnad Bcl-2-familjeproteinberoende mönster är inte uppenbara i hela cell immunoblots

Immunoblots av multidomän Bcl-2-proteiner från NB-helcelllysat demonstrerade variabelt och redundant pro-survival proteinuttryck (figur 4). De flesta uttryckte Bax och Bak på lätt detekterbara nivåer, medan KCN och SMS-SAN hade minskat Bak-uttrycket. Av dessa visade SMS-SAN-celler robust cytokrom c- frisättning i våra funktionella analyser vilket tyder på att Bak inte krävs för denna process (t.ex. Bax kan räcka) eller att mängden Bak närvarande är tillräcklig. För Bcl-2-proteiner för överlevnad verkade expressionsnivåer inte definiera mitokondriell resistens mot BH3-peptider, eftersom SK-N-AS, CHP134 och BE2C inte markant uttryckte något speciellt pro-survival-protein i förhållande till känsliga cellinjer. Emellertid fanns det en anmärkningsvärd minskning av Mcl1-uttryck som definierade celler med BikBH3-känsliga mitokondrier (Bik-dominerande). Bakproteinnivåer reduceras också i samma celler möjligen genom förlust av Mcl1s stabiliseringspåverkan på Bak. 17 Därför kan lågt Mcl1-protein vara en biomarkör för en Bik-dominerande svarsprofil.

BH3-profilering förutsäger känslighet för Bcl-2-familjantagonister

För att validera att BH3-profileringen noggrant identifierade cellulära Bcl-2-familjeproverlevnadsberoende, behandlade vi NB-celler in vitro med små molekylantagonister av Bcl-2-proteiner. ABT-737 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) binder till Bcl-2, Bcl-xL och Bcl-w med subnanomolär affinitet (Ki <1 nM), medan AT-101 (Ascenta Therapeutics, Malvern, PA, USA) binder till Bcl-2 och Bcl-xL mindre kraftigt ( K > 300 nM) men har något högre aviditet för Mcl1 ( K i ∼ 180 nM). 18, 19 Dessa molekyler återupptar apoptos primärt genom att störa endogena Bcl-2-familjinteraktioner och hämma sekvestrering av pro-death BH3-proteiner 18 även om ytterligare mekanismer har föreslagits för AT-101. 20

NB-celler som visade en Noxa-dominerande profil (t.ex. IMR5, NLF) var mest känsliga för Mcl1-neutraliserande AT-101 med en IC50 i området 2 μM och med nästan fullständig cytotoxicitet vid 5 μM för varje; Figur 5a. ABT-737 är en kraftigare hämmare av sina målproteiner, men ändå krävdes högre koncentrationer för liknande cytotoxicitet i dessa cellinjer, antagligen eftersom Mcl1 inte är antagoniserad. På grundval av våra mitokondriella profiler kan svar på ABT-737 återspegla antagonism av Bcl-xL eller Bcl-w eftersom BikBH3 är den näst mest potenta peptiden bakom NoxaBH3. Däremot var NB-celler med en Bik-dominerande svarsprofil (t.ex. LAN5, SMS-KCN) utsökt känsliga för ABT-737 med IC 50s - 200 nM, två loggar mindre än för AT-101 eller för IMR5-känslighet för ABT-737 (Figur 5b). Därför fungerar en dominerande BikBH3-profil som en prediktor för utsökt ABT-737-känslighet och våra data antyder att detta till stor del är genom reducerat Mcl1-uttryck och funktion.

Image

BH3-profilering förutspår NB-cellkänslighet för småclolekylantagonister i familjen Bcl-2. 30 000 celler pläterades i 96-brunnars plattor i duplikat, fick sedimentera över natten och exponerades för ökande koncentrationer av AT-101, ABT-737 eller DMSO-kontroll. Cellindex (livskraftigt cellnummer) för duplicerade brunnar är i genomsnitt och plottas som en funktion av tiden och normaliseras separat till cellindexavläsningen för varje brunn vid tiden precis före läkemedelsaddition ( t = 0). Celler med Mcl1-beroende var mer känsliga för AT-101 ( a ). Celler med en Bik-dominerande mitokondriell profil var utsökt känsliga för ABT-737 ( b ). Cytotoxicitetskurvor representerar genomsnittet av minst två separata experiment. Standardavvikelser mellan enskilda experiment var alla mindre än 5% av de planerade värdena och visas därför inte. μM , mikromolär; nanoM, nanomolar

Bild i full storlek

SK-N-AS och BE2C var okänsliga för de högsta doserna av ABT-737 och hade minimal celldöd till doser av AT-101 som var cytotoxiska för andra cellinjer (figur 6). RPE-1-neuralcellkontrollen var också fullständigt resistent mot ABT-737, såsom förutses av dess BH3-profil, och visade känslighet för AT-101 jämförbar med NB-cellinjer med möjliggörande BH3-profiler (figur 6). Därför förutsäger mångfald i mitokondriella svar på BH3-dödsignaler exakt pro-överlevnad Bcl-2-proteinberoende-mönster inom en cellinje som framgångsrikt kan riktas med små molekyl BH-antagonister.

Image

OBS-resistent mot möjliga BH3 och normala cellkontroller är resistenta mot små molekyl Bcl-2-familjantagonister. RPE-1 är en vidhäftande icke-transformerad neural cellinje. Cytotoxicitetskurvor representerar genomsnittet av minst två separata experiment. Standardavvikelser mellan enskilda experiment var alla mindre än 5% av de planerade värdena och visas därför inte

Bild i full storlek

Diskussion

Komplexitet finns bland Bcl-2-proteininteraktioner som förmedlar mitokondriell apoptos. Post-translationella modifieringar (PTM), redundans för dödsstimuli och olika tillhörigheter bland Bcl-2-proteiner gör uttrycksbaserade förutsägelser opålitliga. Analys av mitokondrier för funktionella svar på BH3-stimuli definierade pro-survival-beroende-mönster som var heterogena men reproducerbara. Klusteranalyser definierade delmängder av NB med ett Mcl1-beroende (Noxa-dominerande profil), Bcl-xL och / eller Bcl-w-beroende (Bik-dominant), eller generaliserat motstånd mot aktiverande BH3-signaler (som uppstår i återfallna tumörer). Pro-överlevnad Bcl-2-proteiner uttrycktes heterogent och förutspådde i allmänhet inte deras funktionella roll vid apoptosundertryckning, även om reducerat Mcll-proteinuttryck kan vara en biomarkör för det Bik-dominerande klustret. PTM kan förändra Bcl-2-familjefunktioner, såsom deamidering av Bcl-xL eller fosforylering av Bcl-2, vilket bidrar till överensstämmelse mellan överflöd och funktion. Identifiering av mitokondriell membran-bosatta Bcl-2-familjeproteiner och deras PTM: er kan hjälpa till att urskilja ytterligare biomarkörer som definierar BH3-svarskluster.

Inte alla BH3-peptider var lika effektiva att inducera cytokrom c- frisättning i NB. I överensstämmelse med fynd från många laboratorier var 21 Bid och Bim mest potent i våra analyser och mötte eller överskred styrkan hos rekombinant tBid. I den "direktaktiverande modellen" av mitokondriell apoptos tillskrivs den större aktiviteten för Bid och Bim deras unika förmåga att fysiskt engagera och aktivera Bak eller Bax (som experimentellt visat för Bax 22 ). De återstående BH3-endast proteinerna (t.ex. Bik och Noxa) är mindre effektiva eftersom deras affinitet är begränsad till pro-survival Bcl-2-proteiner. 7, 8, 23 De möjliggör apoptos genom neutralisering av Bcl-2-fickor utan överlevnad, men förblir beroende av aktivator BH3-proteiner för att engagera Bak eller Bax. Alternativt föreslår modellen "indirekt-aktivator" den pro-apoptotiska funktionen för endast BH3-proteiner resultat från deras kollektiva antagonism mot de pro-survival Bcl-2-proteiner som håller Bak och Bax i ett inaktivt tillstånd. 24, 25 Den mer potenta apoptosinducerande aktiviteten hos vissa BH3-proteiner jämfört med andra tillskrivs deras bredare affinitet. Bid och Bim engagerar ett större antal pro-survival-proteiner som neutraliserar deras antagonism mot Bak och Bax och ökar sannolikheten för att tillräckliga Bak eller Bax är fria för att aktivera apoptos. Båda modellerna stöds av betydande experimentell data och är inte nödvändigtvis exklusiva.

Med hjälp av samimmunutfällning fann vi att Bim var toniskt sekesterad till pro-survival-proteiner i NB-celler som växte i stabilt tillstånd (figur 3b). Dessutom kunde mitokondrier härrörande från samma celler induceras till att frisätta cytokrom c efter exponering för möjliga BH3-peptider med begränsad affinitet för endast en undergrupp av Bcl-2-proteiner, såsom NoxaBH3 för Mcl1 (som med IMR5, figur 1) som antyder en ' grundad för dödsstatus i överensstämmelse med direktaktivatormodellen. Dessutom inducerade en delmängd av möjliggörande cellinjer endast förmodad aktivator BH3-peptider frisättning av cytokrom c , medan kombinationer av möjliggörare som på liknande sätt neutraliserar alla medlemmar av pro-överlevnad förblev ineffektiva (data visas inte). Faktum är att SK-N-AS-celler visade liten frisättning för att möjliggöra BH3-peptider. Ändå efter exponering för en sublethal etoposidkoncentration (1 log lägre än IC 50 ) ökades mitokondriella svar på möjliggörande peptider (figur 3c) vilket ledde till efterbehandling av SK-N-AS mitokondrier kluster med den Noxa-dominerande gruppen (figur 2a ).

I våra studier inducerade PumaBH3 inte robust cytokrom c- frisättning, vilket strider mot våra förväntningar. Den relativa svagheten hos PumaBH3 i våra analyser kunde inte tillskrivas en oförmåga att bilda en stabil a- helix (väsentlig för pro-death-funktion, 26 ) eftersom cirkulära dikroismanalyser visade helicity jämförbar med andra testpeptider (data visas inte). Peptidsekvensen har rapporterats vara mycket aktiv i liknande analyser. 8 Med tanke på Pumas icke-selektiva och promiskuösa affinitetsprofil (tabell 1) är det fortfarande inte troligt att det har förändrat vår gruppering eller slutsatser om beroende av pro-överlevnad även om det var mer aktivt.

Mitokondriella BH3-svarsprofiler förutspådde exakt hela cellkänslighet för små molekyl Bcl-2-familjantagonister, och kan visa sig vara användbara vid utvärdering av terapeutiska strategier riktade mot kemoresistens i NB. Även om AT-101 var mer potent mot Mcl1-beroende cellinjer (Noxa-dominerande) förblev det blygsamma känsligheten för AT-101 vid mitten av mikromolära koncentrationer i alla celler, inklusive icke-transformerade celler. Gossypol (den racemiska enantiomeren av AT-101) är cytotoxisk för musembryo-fibroblaster genetiskt noll för Bax och Bak 20 eller caspase 9, 27 som stöder ytterligare cytotoxiska effekter utöver Bcl-2-familjantagonism. The reduced sensitivity of Noxa-dominant NBs to AT-101 (relative to ABT-737 effects against Bik-dominant NB) may be due to its lesser affinity for Mcl1 in comparison to ABT-737 affinity for its targets. ABT-737 activity at micromolar concentrations against Noxa-dominant cells likely reflects a co-dependence on Bcl-xL and Bcl-w suggested by the substantial BikBH3 response. Mcl1 may provide the primary barrier to ABT-737 sensitivity in this subset, as in other cancer models. 5, 20, 28, 29 Indeed, our laboratory has shown that siRNA inhibition of Mcl1 in Noxa-dominant cells is cytotoxic and enhances sensitivity to ABT-737 at doses as low as 1 nM. 30 Therapeutic opportunities for this group include Mcl1-antagonizing small molecules (AT-101 and others) or combination therapies with ABT-737 and agents that neutralize Mcl1 (eg proteosome inhibitors, CDK inhibitors).

Our data showed that ABT-737 was active against NB cells with a Bik-dominant response profile. Previous studies have shown ABT-263, the oral analogue of ABT-737, to be relatively ineffective in a cohort of NB cell lines. 31 In that study, the only ABT-737-sensitive cells were NB-1643, which we now show by BH3 response profiling to have a Bik-dominant pattern predicting sensitivity to Bcl-2, -xL, and/or -w antagonism. Immunoblots of cell lines that were exquisitely sensitive to ABT-737 showed a reduction of Mcl1 protein, providing a potential biomarker for this class.

Finally, our studies showed that post-therapy relapsed NBs typically presented mitochondria resistant to enabler BH3 signals. Thus, emergent therapy resistance may be associated with loss of BH3 priming or effectual Bak/Bax engagement and MOMP activation. As Bax and Bak were present, and their mitochondria could be primed to release cytochrome c after etoposide exposure, we presume the apoptotic machinery downstream of Bcl-2 oversight is intact, and that loss of activator BH3 priming is responsible. Comparing BH3 response profiles from cell lines derived from the same patient pre- and post relapse may help define the acquired apoptosis resistance patterns contributing to chemoresistance.

Further studies using available in vivo models are required to validate these findings. As BH3 profiles from fresh xenografts are largely concordant with monolayer culture results, we conclude that the Bcl-2 set point that defines sensitivity to myriad stressors is hardwired in NB cells and suggests that profiling primary tumors may be used to identify tumor-specific therapeutic targets in the Bcl-2 family. We propose that BH3 profiling may be used not only to further our understanding of solid tumor apoptosis deregulation but also to triage NB and other chemoresistant solid tumors for biologically active agents in this class.

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur S1

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegende

Ordlista

NB

neuroblastoma

Supplementary Information accompanies the paper on Cell Death and Differentiation website (//www.nature.com/cdd)