Balsalazin minskar tarmslemhinnans permeabilitet hos dextransulfat natriuminducerad kolit hos möss | acta Pharmacologica sinica

Balsalazin minskar tarmslemhinnans permeabilitet hos dextransulfat natriuminducerad kolit hos möss | acta Pharmacologica sinica

Anonim

Abstrakt

Syfte:

För att undersöka effekten av balsalazinbehandling på tarmslemhinnans permeabilitet i dextransulfatnatrium (DSS) -inducerad kolit och för att bestämma mekanismen för de balsalazininducerade förändringarna.

metoder:

Experimentell kolit inducerades i C57BL / 6J-möss genom administrering av 5% DSS. Balsalazin administrerades intragastriskt i doser av 42, 141 och 423 mg / kg. Sjukdomens aktivitetsindex (DAI) poäng utvärderades och kolonvävnad samlades för bedömning av histologiska förändringar. Mängden malondialdehyd (MDA) i tjocktarmen bestämdes tillsammans med aktiviteten av myeloperoxidas (MPO), superoxiddismutas (SOD) och glutationperoxidas (GSH-Px). Mukosa från tunntarmen uppsamlades för att bestämma nivåerna av tumornekrosfaktor (TNF) -a och interferon (IFN) -y. Slemhinnan undersöktes ultrastrukturellt med transmissionselektronmikroskopi och tarmpermeabilitet analyserades med användning av Evans blue.

Resultat:

Balsalazin visade sig minska DAI-poängen och det histologiska indexet (HI), minska MDA-innehållet och aktiviteten hos MPO och öka aktiviteten för SOD och GSH-Px i kolitmöss. Samtidigt förbättrade balsalazin mikrovillus och snäv övergångsstruktur, vilket resulterade i en minskning av mängden Evans blått genomträngande in i tarmväggen och nivåerna av TNF-a och IFN-y i kolitmöss.

Slutsats:

Hos kolitmöss resulterar bollalazins anti-koliteffekt i en minskning av tarmslemhinnans permeabilitet. Mekanismen för denna effekt är delvis associerad med balsalazins antioxidativa och antiinflammatoriska effekter.

Introduktion

Tarmslemhinnebarriären spelar en viktig roll när det gäller att förhindra mikroorganismer och bakterietoxiner från att komma in i en organisms blodomlopp. Barriären försämras emellertid under inflammatorisk tarmsjukdom (IBD). Som ett resultat kan en stor mängd endotoxin komma in i systemisk cirkulation genom den försämrade tarmslemhinnan 1, 2 . Dessutom induceras syrefria radikaler (OFR) och proinflammatoriska cytokiner, vilket underlättar försämring av tarmslemhinnans permeabilitet 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 . Oxidanter förändrar cytoskeletalkomponenter (såsom aktin), vilket resulterar i störning av epitelcellens strukturella integritet 10, 11 . Proinflammatoriska cytokiner, inklusive tumornekrosfaktor (TNF) -a och interferon (IFN) -y, stör dessutom trånga korsningar 6, 7, 8, 9, minskar den transendoteliala elektriska resistensen (TEER) och reglerar uttrycket av tarmslemhinnan. barriärassocierade proteiner. Därför är återställande av den försämrade tarmslemhinnan fördelaktig för att kontrollera och minska inflammation och immunologisk reaktion som uppstår i tarmslemhinnan hos patienter med IBD 12 .

5-aminosalicylat (5-ASA) används för att behandla ulcerös kolit (UC) på grund av dess förmåga att kontrollera och lindra inflammation. Sulfasalazin, det första 5-ASA-innehållande läkemedlet, fungerar genom att frigöra en aktiv komponent i tjocktarmen genom aktiviteten av azoreduktas uttryckt av kolonbakterie. Sulfasalazin har godkänts för terapeutisk användning på grund av dess förmåga att förbättra tarmslemhinnans permeabilitet 13, 14 . Balsalazin (5-ASA-azo bunden till en inert bärare, 4-amino-bensoyl-alanin) kan också frisätta 5-ASA genom klyvning av föreningen genom azoreduktas uttryckt av tarm-luminalbakterier. Administrering av balsalazin inducerar effektivt remission hos patienter med mild till måttlig UC. Huruvida balsalazin förbättrar tarmslemhinnans permeabilitet är emellertid fortfarande okänt 15, 16 .

Tidigare studier har visat att slemhinnebarriärfunktion är ett patofysiologiskt inslag i kolit, oavsett etiologi eller art 17, 18 . Därför anses dextransulfatnatrium (DSS) -inducerad kolit vara en lämplig modell för den skadade slemhinnebarriären 19 . Tunntarmsepitelet ligger i tarmbarriärens främre linje. Således kan ökad tunntarmspermeabilitet vara en viktig etiologisk händelse vid kolit 20 . Därför utformades den aktuella studien för att undersöka effekten av balsalazin på tunntarmsslemhinnans permeabilitet i den DSS-inducerade kolitmodellen och de möjliga mekanismerna för dess effekter.

Material och metoder

Djur och reagens

Specifika patogenfria (SPF) -graderade C57BL / 6J-möss, 6–8 veckor gamla och väger 20 ± 2 g, tillhandahölls av Shanghai Slac Laboratory Animal Co Ltd (Shanghai, Kina; Certificate No SCXK 2007-0005). Mössen hölls i djurfaciliteter med 50% fuktighet och en 12: 12-timmars ljusmörkcykel och matades med en vanlig pelletsdiet och kranvatten ad libitum . Balsalazine tillhandahölls av Shanxi Anter Incorporated. DSS (molekylvikt 8000) köptes från Sigma-Aldrich Co. Kit för att detektera Myeloperoxidas (MPO; batchnummer: 080416), glutathionperoxidas (GSH-Px; batchnummer: 080320), malondialdehyd (MDA; batchnummer: 080321), superoxid dismutase (SOD; batchnummer: 080320) och Evans blue (EB) köptes alla från Nanjing Jiancheng Biotechnology Institute (Nanjing, Kina). ELISA-satserna för TNF-a (batchnummer: 080621) och IFN-y (batchnummer: 080510) erhölls från Jingmei Biotech Co Ltd (Shenzhen, Kina). De viktigaste instrumenten som användes i denna studie var en ultraviolett spektrofotometer (752N; Shanghai, Kina), ett enzymmärkande instrument (ELx800; USA), ett transmissionselektronmikroskop (TEM; Hitachi, Japan), ett ljusmikroskop (Olympus; Japan) och en höghastighetsreglerbar homogenisator (FSH 2; Kina).

Experimentella protokoll

Alla experiment genomfördes i enlighet med de institutionella och nationella riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur och godkändes av Etikkommittén vid Anhui Medical University. Fyrtiofem C57BL / 6J-möss delades slumpmässigt in i följande fem grupper: en normal grupp, en DSS-behandlad grupp och tre balsalazingrupper behandlade i doser av 42 mg / kg, 141 mg / kg och 423 mg / kg enligt till studien av Kimura et al. Balsalazin återsuspenderades i destillerat vatten och administrerades intragastriskt till behandlingsgrupperna en gång dagligen från den första dagen (d1) i experimentet och varade i 7 dagar. Alla andra grupper fick destillerat vatten som kontroll 21 .

Induktion av kolit

Akut kolit inducerades i möss genom att ersätta normalt dricksvatten med destillerat vatten innehållande 5% ( vikt / volym ) DSS och låta dem dricka fritt under 7 dagar 22 . Mössen i DSS-gruppen och de tre balsalazingrupperna drack alla 5% DSS, och mössen i kontrollgruppen fick regelbundet destillerat vatten.

Utvärdering av DAI

Under hela experimentets längd registrerades följande parametrar för varje mus dagligen av två oblindade observatörer: vikt, närvaro av ockult eller grovt blod i avföring och avföringskonsistens. Dessa parametrar tilldelades var och en en poäng och användes för att beräkna en genomsnittlig daglig sjukdomsaktivitetsindex (DAI) poäng för varje mus som tidigare beskrivits 22 .

Kirurgisk procedur

Mössen avlivades genom klorhydratanestesi efter 7 dagars DSS-administration. Buken öppnades längs medianlinjen, och kolon skars snabbt ut, sköljdes försiktigt med iskall fosfatbuffrad saltlösning, placerades på is och öppnades i längdriktningen. Två kontinuerliga bitar samlades in efter att grova morfologiska förändringar av kolonslemhinnan undersöktes. En del av kolon fixerades omedelbart i 10% neutralt buffrat formalin för histologisk analys. Det andra tjocktarmsegmentet homogeniserades för användning vid bedömningen av MDA-innehåll, tillsammans med aktiviteten hos MPO, SOD och GSH-Px. Homogenatet lagrades vid -20 ° C. Småtarmsslemhinna uppsamlades för TEM-analys, bedömning av permeabilitet med Evans blue och nivåer av TNF-a och IFN-y.

Histologisk bedömning

Delen av kolon fixerad i 10% neutral buffrad formalin inbäddades i paraffin för histologisk analys. Sektioner i full tjocklek (5 um) färgades med hematoxylin och eosin och undersöktes mikroskopiskt av en blindad patolog som inte var medveten om den experimentella utformningen av studien. Svårighetsgraden av kolit graderades på en skala 0–4 och uttrycktes som det patologiska indexet enligt det normala poängsystemet 22 .

Bedömning av TEM

Ileum inom 0, 5 cm från ileocecal-korsningen (cirka 1 cm) skars ut med en skarp skalpell. Prover behandlade för TEM fixerades i 2, 5% glutaraldehyd under fyra timmar vid 4 ° C, följt av fixering i osminsyra och inbäddade i Epon. Ultratinsektioner undersöktes av TEM.

Bestämning av tarmpermeabilitet med Evans blue

Tunntarmsäckarna framställdes såsom beskrivits tidigare 23, 24 . I korthet snittades tunntarmen och fecalt innehåll tvättades försiktigt med 2-3 ml PBS. De proximala och distala tarmarna ligerades och 0, 2 ml 1, 5% ( vikt / volym ) Evans blue (EB) i PBS infunderades i lumen. Säcken inkuberades sedan i 20 ml Krebs-buffert i 95% 02 vid 37 ° C under 30 minuter. Säcken tvättades tre gånger i 6 mmol / L acetylcystein och torkades på filterpapper vid 37 ° C under 24 timmar, följt av inkubering med 1 ml formamid vid 50 ° C under 24 timmar. Mängden eluerat färgämne uppskattades till en våglängd av 655 nm. Mängden EB som genomsyrar tarmväggen beräknades baserat på standardkurvan för EB i formamid.

Detektioner av kolon- och tarmshomogenat

Den dissekerade kolon och tarmen skars ut och allt fett och mesenterier avlägsnades. Vävnaden homogeniserades därefter i fysiologisk saltlösning och lagrades vid -20 ° C tillfälligt. Detektering av mängden MDA och aktiviteterna för MPO, SOD och GSH-P X bestämdes enligt tillverkarens riktlinjer. Nivåerna av TNF-a och IFN-y i tunntarmshomogenat bestämdes med användning av ELISA-satser.

Statistisk analys

Den statistiska programvaran som användes var SPSS11.5. Alla analyser uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Gruppjämförelser utfördes med användning av envägsanalysstest (ANOVA) -testet och korrelationer testades med Pearsons rangkorrelationskoefficient. Ett P- värde <0, 05 ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

Effekten av balsalazin på DSS-inducerad kolit

Administrering av en 5% DSS-lösning i dricksvattnet resulterade i kolit hos dessa möss. Induktionen av kolit återspeglas av närvaron av blodig avföring, diarré och viktminskning. DAI-poängen ökade från dag 5 (d 5) och alla möss hade onormala avföringar under experimentet. Balsalazinbehandling minskade signifikant DAI-poängen jämfört med DSS-gruppen ( P <0, 05, figur 1).

Effekter av balsalazin på DAI-poäng med administrering av 5% DSS under 7 dagar ( n = 9). Djurvikter, närvaro av ockult eller grovt blod i avföringen och avföringskonsistens registrerades dagligen för varje djur för att beräkna ett genomsnittligt dagligt sjukdomsaktivitetsindex (DAI). (A) Normal grupp; (B) DSS-grupp; (Cl) balsalazin 42 mg / kg; (C2) balsalazin 141 mg / kg; (C3) balsalazin 423 mg / kg. DAI var signifikant hög och ökade dagligen i DSS-gruppen. DAI i balsalazingrupperna var lägre än i DSS-gruppen ( P <0, 05 från d5 genom ANOVA-test).

Bild i full storlek

Kolonslemhinneskador utvärderades i slutet av experimentet. Balsalazine försvagat slemhinnahyperemi och ödem. Dessutom reducerade balsalazin graden av kolonslemhinneskador genom att reducera HI-poängen från 7, 66 ± 1, 00 i DSS-gruppen till 5, 66 ± 0, 71, 4, 11 ± 0, 78 och 2, 22 ± 0, 44 i 42 mg / kg, 141 mg / kg och 423 mg / kg balsalazindosgrupper, respektive (figur 2). Såsom visas i figur 3B inducerade DSS-behandling multifokala ytliga magsår i kolonslemhinnan, inflammatoriska celler infiltrerades huvudsakligen i slemhinnan och submukosa, tillsammans med ödem i submukosa och folliculus lymfus. Dessutom skadades epitelceller och kolon-krypter och förlorades allvarligt. I balsalazinbehandlingsgrupperna fanns emellertid mild inflammationinfiltrering, integrerat ytepitel och dämpad kryptcellförlust (figur 3C). Dessa resultat indikerade att balsalazin hade betydande anti-koliteffekter.

Effekter av balsalazin på HI-poäng med administration av 5% DSS efter 7 dagar ( n = 9). (A) Normal grupp; (B) DSS-grupp; (Cl) balsalazin 42 mg / kg; (C2) balsalzin 141 mg / kg; (C3) balsalazin 423 mg / kg. Svårighetsgraden av kolit graderades på en skala från 0–4 och uttrycktes som det patologiska indexet enligt det normala poängsystemet. HI var signifikant hög i DSS-gruppen. HI i balsalazingrupperna var lägre än i DSS-gruppen. ( bP <0, 05, cP <0, 01 vs DSS-grupp genom ANOVA-test).

Bild i full storlek

Histopatologiska egenskaper hos tjocktarmen i samband med kolit (HE × 400). A: normal grupp, B: DSS-grupp, C: balsalazin-grupp. Ingen histologisk skada sågs i den normala gruppen. DSS-gruppen visade svår inflammatorisk cellinfiltration i slemhinnor och submukosa, och ytepitelcellen och krypterna skadades och förlorades allvarligt. Balsalazingruppen uppvisade mild inflammation, integrerat ytepitel och dämpad kryptcellförlust.

Bild i full storlek

Effekten av balsalazin på tarmslemhinnebarriärfunktionen vid DSS-inducerad kolit

Integriteten hos tarmslemhinnebarriären är resultatet av strukturen hos tarmens epitelceller och de mellancellulära snäva korsningarna. Jämfört med kontrollgruppen (figur 4A) visade DSS-gruppen (figur 4B) följande förändringar: en fokal reduktion av tarmmikrovillus, misslyckande av epitelytan, oregelbunden breddning av det intercellulära utrymmet, dekurterade och bredare korsningskomplex och delvis ytepitelskada, till och med lossning av epitelet. Däremot uppvisade de balsalazinbehandlade grupperna (figur 4C, 4D och 4E) en dämpning av ytepitelskadorna, regelbundna och intensiva mikrovillier och förbättrade snäva korsningar.

Effekter av balsalazin på ileal slemhinnans epitelstruktur under TEM (× 20 000). A: normal grupp, B: DSS-grupp, C, D, E: balsalazin 42, 141 respektive 423 mg / kg. Inga uppenbara mikrostrukturella skador sågs i den normala gruppen. I DSS-gruppen sågs reducerad och kortare mikrovillus, oregelbunden utvidgning av det intercellulära utrymmet, dekurterade och bredda förbindningskomplex. Balsalazingrupperna uppvisade en mycket mer regelbunden och intensiv mikrovillus och förbättrade dos-beroende korsningar.

Bild i full storlek

Samtidigt var mängden EB genomträngande in i tarmväggen i den DSS-inducerade gruppen 281, 43 ± 7, 06 μg / g, vilket var markant högre än i kontrollgruppen (90, 07 ± 5, 20 μg / g, P <0, 01). Dessa data indikerar att tarmslemhinnans permeabilitet ökades hos DSS-inducerade kolitmöss. Behandlingen av DSS-inducerade kolitmöss med 42 mg / kg, 141 mg / kg och 423 mg / kg balsalazin sänkte mängden EB som trängde in i tarmväggen till 210, 99 ± 6, 55 μg / g, 166, 30 ± 7, 14 μg / g och 110, 47 ± 6, 78 μg / g ( P <0, 05). Dessa resultat indikerar att balsalazinbehandling skyddar tarmslemhinnan i denna kolitmodell.

Effekten av balsalazin på tarmslemhinnans oxidativa skador i den DSS-inducerade kolitmodellen

Jämfört med kontrollgruppen ökade administrationen av DSS mängden MDA och aktiviteten av MPO i tjocktarmen, medan aktiviteten för både SOD och GSH-Px minskade ( P <0, 01). Alla tre doserna av balsalazin reverserade de DSS-inducerade förändringarna beskrivna ovan ( P <0, 05, tabell 1). Korrelationskoefficienterna mellan DAI och antingen MDA, SOD eller GSH-Px var 0, 718, -0, 837 respektive -0, 839. Korrelationskoefficienterna mellan HI och antingen MDA, SOD eller GSH-Px var 0, 818, -0, 946 respektive -0, 957. Korrelationskoefficienterna mellan mängden EB och antingen MDA, SOD eller GSH-Px var 0, 842, -0, 960 respektive -0, 900. Dessa resultat indikerade att balsalazin kunde rensa fria radikaler och dämpa den oxidativa skadan. Dessutom fanns ett starkt samband mellan oxidativa index och mängden EB.

Full storlek bord

Effekten av Balsalazin på tarm TNF-a och IFN-y nivåer i DSS-inducerad kolit

Jämfört med kontrollgruppen ökade DSS-administration signifikant nivåerna av tarm TNF-a och IFN-y ( P <0, 01). Dessa data indikerar betydande tarminflammation i DSS-gruppen. Emellertid var nivåerna av tarm-TNF-a och IFN-y mycket lägre i de balsalazinbehandlade grupperna än i DSS-gruppen ( P <0, 05, tabell 2). Korrelationskoefficienterna mellan mängden EB och nivåerna av tarm TNF-a eller IFN-y var 0, 887 respektive 0, 948. Dessa resultat indikerar att balsalazin reducerar nivån av proinflammatoriska cytokiner och dämpar tarminflammationen.

Full storlek bord

Diskussion

I den aktuella studien resulterade behandlingen av kolitmöss med balsalazin i en uppenbar anti-koliteffekt. Fysiologiskt dämpade eller förhindrade balsalazin blodig avföring, diarré och viktminskning. Dessutom minskade administrationen av balsalazin både DAI och HI-poängen och sänkte MPO-aktiviteten i den DSS-inducerade kolitmodellen. Effekten av balsalazin på tarmslemhinnans permeabilitet återspeglas vanligtvis av förändringar i tarmens funktion och struktur. En ökning av mängden EB som genomsyrar in i tarmväggen, en störning i epitelcellsgränserna och skador på tarmens epitelceller och mellancellulära snäva korsningar indikerade allt att tarmslemhinnans permeabilitet ökades i DSS-gruppen 19, 23 . Administrering av balsalazin minskade signifikant den DSS-inducerade ökningen av tarmslemhinnans permeabilitet. Därför indikerar dessa resultat att de gynnsamma effekterna av balsalazin på tarmslemhinnebarriären kan leda till depression av tarminflammatorisk patologi och efterföljande dämpning av koloninflammation. Emellertid har de underliggande mekanismerna för tarmslemhinnans permeabilitet förbättrats genom balsalazinbehandling inte studerats. Att förstå dessa mekanismer kommer att bidra till att belysa balsalazins roller i patogenesen av UC.

Syrefria radikaler (OFR) spelar en viktig roll i patogenesen av UC 25 och har visat sig skada tarmslemhinnebarriären 26 . Förlusten av antioxidantförsvar kan allvarligt kompromettera den inflammerade slemhinnan och göra det mer mottagligt för den syreinducerade skada och därmed hindra återhämtningen av slemhinnan och återvändandet av integritet hos epitelcellskiktet. Således ökade det tarmslemhinnans permeabilitet 27, 28, medan antioxidantbehandling är fördelaktig för att förbättra tarmslemhinnans permeabilitet 29, 30, 31, 32, 33, 34 . I den aktuella studien dämpade balsalazin oxidativ skada på tarmen markant genom att minska MDA-innehållet, tillsammans med ökande SOD- och GSH-Px-aktivitet. Med tanke på det starka sambandet mellan oxidativa index och EB antar vi således att antioxidationseffekten av balsalazin kan bidra till förbättring av tarmslemhinnans permeabilitet.

IFN-y och TNF-a anses vara de viktigaste cytokinerna i patogenesen av UC. Interaktionen mellan IFN-y, TNF-a och slemhinnans immunsystem kan leda till störning av epitelbarriären. TNF-a kan också stimulera syntesen av OFR och andra inflammatoriska mediatorer och därmed förstärka störningen av epitelbarriären 35 . Vidare kan apoptos av ileala enterocyter förebyggas genom både anti-TNF-strategier och i TNFR-1 - / - djur 36, 37 . I vår studie minskade balsalazin halterna av tarm IFN-y och TNF-α. Dessa resultat liknar de resultat som beskrivs av Fiorucci et al 38 . Vidare visade Kim et al att 5-ASA försvagat TNF-beroende NF-KB-aktivering, vilket kan vara kritiskt under tarminflammation 39 . Med tanke på dessa resultat och den starka korrelationen mellan tarmnivåerna för IFN-y och TNF-a och mängden EB, antar vi att balsalazin skyddar tarmslemhinnebarriären delvis genom att hämma de proinflammatoriska cytokinerna.

Sammanfattningsvis berodde den gynnsamma anti-koliteffekten av balsalazinbehandling på dess förmåga att återställa både strukturen och funktionen i tarmslemhinnebarriären. Mekanismerna genom vilka balsalazin återställde integriteten hos tarmslemhinnebarriären är delvis associerade med den antioxidativa och antiinflammatoriska effekten av balsalazin. Dessa mekanismer kräver dock ytterligare utredning. Mer avancerade metoder, inklusive molekylärbiologiska tekniker för att upptäcka förändringar i tarmslemhinnebarriärassocierade proteiner, kommer att tillämpas i framtida studier.

Författares bidrag

Xiao-chang LIU designade och genomförde studien. Qiao MEI och Jian-ming XU designade studien. Jing HU genomförde en del av studien tillsammans med Xiao-chang LIU.