Balansera inflammation och tolerans in vivo genom dendritiska celler från den kommensala candida albicans | slemhinneimmunologi

Balansera inflammation och tolerans in vivo genom dendritiska celler från den kommensala candida albicans | slemhinneimmunologi

Anonim

Abstrakt

Vi analyserade bidraget från intracellulär signalering till den funktionella plastisiteten hos dendritiska celler (DC) som presenterar Candida albicans , ett humant kommensal förknippat med allvarliga sjukdomar. Distinkta intracellulära vägar aktiverades genom igenkänning av olika svampmorfototyper i distinkta DC-underuppsättningar och i Peyers plåster DCs. Inflammatoriska DC: er initierade Th17 / Th2-svar på jäst genom adapterens myeloida differentieringsfaktor-88 (MyD88), medan tolerogena DC: er aktiverar Th1 / T-regulatorcell (Treg) -differentieringsprogram till hyfer som involverar Toll / IL-1-receptor-domäninnehållande adapter som inducerar IFN -BETA (TRIF) som en mellanhand för signalering. Dessutom har signalomvandlare och aktivator av transkription 3 (STAT3), som påverkar balansen mellan kanonisk och icke-kanonisk aktivering av kärnfaktor-kappaB (NF-kB) och 2, 3 indoleamindioxygenas (IDO), bidragit centralt till DC-plastisitet och funktionell specialisering. Eftersom Candida- inducerade tolerogena DC: s förhindrade experimentell kolit, kvalificerar våra data Candida som ett commensal med immunreguleringsaktivitet, vilket är resultatet av den orkestrerade användningen av flera, men ändå funktionellt distinkta, receptorsignalerande vägar i DC. I slutändan kan påverkan av den lokala Th17 / Treg-balansen troligen utnyttjas av svampen för antingen kommensalism eller patogenicitet.

Introduktion

Även om Candida albicans är förknippad med ett antal allvarliga sjukdomar är främst en mänsklig kommensal av slemhinnor och hudytor, ett tillstånd som kräver en dubbelriktad interaktion med värdens immunsystem. Faktum är att inte bara svampen skulle dra nytta av ett lokalt antiinflammatoriskt / tolerogent tillstånd för sin egen persistens, 1 utan genom modulering och induktion av lokala reglerande T-celler (Tregs) som kan dämpa medfödd och anpassningsbar immunitet, 2 C. albicans själv kan också bidra till upprätthållandet av ett tolerogent tillstånd i tarmen. Emellertid skulle den dubbla naturen hos kommensal och patogen förutsäga att svampen skulle kunna modulera immunreaktivitet i motsatta riktningar. I själva verket har förutom infektion ett antal dysreglerade immunreaktiviteter associerats med svampen och / eller vissa svampkomponenter. 3

Utnyttjandet av distinkta igenkänningsreceptorer i dendritiska celler (DC) bestämmer hela området för värdens immunförhållanden med C. albicans . 4, 5, 6 I likhet med vad som har rapporterats med mononukleära fagocyter, kommer 7, 8 distinkta intracellulära signalvägar sannolikt att spela en roll i variationen i antifungala immunsvar från DC. Stimuli, inklusive Toll-liknande receptor (TLR) agonister och endogena molekyler, instruerar differentiellt DC: er att initiera Th-svar genom modulering av intracellulära signalvägar. 9 En mängd bevis tyder på att DC-immunogenicitet / tolerogenicitet inte är ett kännetecken för en specifik delmängd eller avstamning av DC: er, utan ett miljömässigt förvärvat drag. I detta avseende bidrar tryptofan-metabolsvägen svängbart till DC-reglering, så att tolerans och Tregs-induktion skulle kunna förmedlas av DC: er som uttrycker enzymet, 2, 3 indoleamindioxygenas (IDO). 10, 11

I den här studien försökte vi bestämma vilka molekylära mekanismer som ligger till grund för plastsvaret från DC: er på Candida och de funktionella konsekvenserna i termer av immunsvar och immunhomeostas in vivo . Vi studerade jämförelsevis DC-ben av benmärg, kända för sin specialisering och komplementaritet i svampdödande primering och tolerering in vivo 11 och Peyers plåster (PP) -DC, kända för sin immunreguleringsfunktion vid slemhinnekandidiasis. 12 Vi fann att Candida utnyttjar flera, funktionellt distinkta, receptorsignalerande vägar i DC: s slutligen påverkar det lokala inflammatoriska / antiinflammatoriska tillståndet i tarmen.

Resultat

Aktivering av distinkta intracellulära kinaser i GM-DC och FL-DC

Aktiveringen av intracellulärt mitogen-aktiverat proteinkinas (MAPK), extracellulära signalreglerade kinaser (ERK1 / 2), Jun N-terminala kinaser 1 och 2 (JNK 1/2) och p38, spelar en viktig roll i DC-funktion. 13 Vi utförde först en proteomisk matrisanalys för att samtidigt detektera den relativa fosforyleringen av 19 kinaser i DC: er som härrör från murin benmärg med användning av antingen GM-CSF / IL-4 (GM-DC: er) som ger en delmängd DC mycket lik CD8a-splenisk inflammatorisk DC — eller FLT3-L ( fms- liknande tyrosinkinas 3-ligand) (FL-DCs) - som är känd för att expandera konventionella CD8-, CD8 + och plasmacytoid (p) B220 + DC vid steady-state. 14 Resultaten visade att Candida- jästar och hyfer 30 minuter efter exponeringen utlöste fosforylering av ERK1 / 2, JNK och fosfoinositid-3-kinas (PI3K) -Akt i GM-DC och fosforylering av p38 och glykogen-syntas-kinas- 3a / p i FL-DC: er (kompletterande figur S1). Bedömd över tid fanns skillnader i storleken och varaktigheten av ERK1 / 2, JNK, p38 MAPK och Akt fosforylering inducerad av de olika stimuli. I överensstämmelse med iakttagelsen att hyfer överlever längre än jäst i DC, 15 aktiverades ERK1 / 2 och JNK i GM-DC längre (2-12 timmar) som svar på hyfer och övergående (0, 5–2 timmar) som svar på jäst och liknande var p38-aktivering i FL-DCs som svar på hyfer (figur la och b). Aktivering, däremot, ökades tidigt som svar på jäst men sent som svar på hyfer (figur 1a). Bekräftande av den proteomiska analysen, aktiveringen av ERK1 / 2 i FL-DC och p38 i GM-DC som svar på någon av stimuli var svaga och övergående (figur 1a och b), medan JNK- och Akt-signalvägar inte detekterades i FL -DC: er (data visas inte).

Aktivering av distinkta intracellulära kinaser i dendriticcell (DC) undergrupper av Candida albicans . Nivåer av extracellulära signalreglerade kinaser (ERK1 / 2), fosfo SAPK / JNK (Thr183 / Tyr185) (JNK1 / 2), p38 mitogen-aktiverat proteinkinas (MAPK) och Akt fosforylering vid olika tidpunkter efter stimulering av GM-CSF / IL-4-härledda (GM) eller FLT3L-härledda (FL) DC från benmärgen från ( a, b ) C57BL / 6, ( c, d ) Tollliknande receptor (TLR2), TLR4, myeloid differentieringsfaktor- 88 (MyD88) eller Toll / IL-1 receptor domäninnehållande adapter som inducerar IFN-beta (TRIF) -möss med mus med levande oponiserade Candida- jäst (svarta histogram) eller hyfer (grå histogram). Data presenteras som immunoblott av celllysat med fosforyleringsspecifika antikroppar och vikningsökningar (pixeltäthet) i fosforylerade till totala proteinkvoter eller till p-tubulin (p-bad). Scanning densitometry utfördes på en Scion Image-apparat. Immunoblots omplottades för p-aktin för att säkerställa lika proteinbelastning. Värdena är representativa för fem experiment.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Därefter bedömde vi det relativa bidraget från myeloida differentieringsfaktor-88 (MyD88) och Toll / IL-1-receptor-domäninnehållande adapter som inducerar IFN-beta (TRIF), med tanke på deras roll i den funktionella mognaden och specialiseringen av murint benmärgs-härledd DC undergrupper 16 och uppströms TLR, kända för att spela en roll i det adaptiva immunsvaret på svampen, 2, 8 vid aktivering av MAPK. ERK-aktivering minskades i frånvaro av TLR2 eller MyD88 i GM-DC, medan p38-fosforylering minskades i frånvaro av TLR4 eller TRIF i FL-DC. Dessutom antydde upptäckten att någon av MAPK: er motsatt reglerades av MyD88 och TRIF i motsvarande DC-underuppsättning, dvs ökad ERK-aktivering i frånvaro av TRIF och p38-aktivering i frånvaro av MyD88, antyder förekomsten av en ömsesidig reglering mellan dessa två signalvägar i DC (figur 1c och d). I likhet med ERK, JNK och Akt ökades fosforyleringen kraftigt i Trif - / - GM-DC (data visas inte), vilket antyder ytterligare att TRIF fungerar som en negativ regulator för dessa signalvägar i DC.

Aktivering av distinkta kärnfaktor-kappaB-vägar i GM-DC eller FL-DC

Kärnfaktor-kappaB (NF-KB) transkriptionsfaktorer är viktiga för att reglera utveckling, överlevnad och cytokinproduktion med DC. 17 NF-kB kan aktiveras genom två distinkta signaltransduktionsvägar, den kanoniska vägen som kulminerar med DNA-bindning av den klassiska NF-kB-dimern, p50-RelA, och kräver IkappaB-kinas-beta (IKKp), eller den icke-kanoniska vägen som är strikt beroende av IkappaB-kinas-alfa (IKKa) och involverar proteolytisk bearbetning av p100 till p52. De två hämmare av kappaB (IkB) kinaskomplexkatalytiska underenheter har motsatta roller i inflammation och immunitet, med IKKa som begränsar den IKKp-beroende inflammatoriska vägen och leder till upplösning av den tidiga inflammatoriska processen och utvecklingen av Tregs. 18 Vi undersökte DC-delmängder för en möjlig aktivering av någon av NF-kB-vägarna som svar på svampen. Fosforyleringen av IKKp, men inte av IKKa, inducerades i GM-DC på ett MyD88-beroende sätt; däremot inducerades både IKKp och IKKa i FL-DC på ett TRIF-beroende sätt, särskilt av hyfer (figur 2a). Tidsförloppsexperiment visade att aktiveringen av den kanoniska NF-kB-vägen stegvis ökade i GM-DC, såsom detekterades genom kärntranslokationen av p65 / p50 vid 180 minuter efter exponeringen, men inte i FL-DC (figur 2b), vid den tidpunkt då den icke-kanoniska vägen istället aktiverades (data visas inte). Denna upptäckt antyder att den kanoniska NF-kB-vägen aktiveras i GM-DC via MyD88 av jäst och hyfer och den icke-kanoniska vägen i FL-DC av hyfer genom TRIF.

Aktivering av distinkta kärnkraftsfaktor-kappaB (NF-KB) och 2, 3 indoleamindioxygenas (IDO) i dendriticcell (DC) undergrupper av Candida albicans . ( a ) Nivåer av IkappaB-kinas-beta (IKKp) eller IkapaB-kinas-alfa (IKKa) -fosforylering vid 90 min av stimulering av benmärgs-härledda GM-DC eller FL-DC, från C57BL / 6, myeloid differentieringsfaktor-88 ( MyD88) eller Toll / IL-1-receptor-domäninnehållande adapter som inducerar IFN-beta (TRIF) -missfärgade möss med levande oponiserade Candida- jästar (Y) eller hyfer (H). Data presenteras som immunoblott av celllysat med anti-fosfo-IKKa (Ser180) / IKKp (Ser181) kaninantikroppar och veckökningar (pixeltäthet) i fosforylerade till totala proteinförhållanden. ( b ) Kanonisk NF-KB-aktivering i GM-DC eller FL-DC vid 180 minuter efter svamp exponering genom elektroforetisk mobilitetsskiftanalys (EMSA). För bandspecificitet inkuberades de nukleära extrakten med antikropparna mot p65 och p50 innan sonden tillsattes. ( c ) IDO-proteinuttryck i DC-underuppsättningar efter 18 timmars stimulering med jäst eller hyfer på tystnad av IKKp eller IKKa med liten interferens-RNA (siRNA). Uttryck av IKKa- och IKKp-transkript utvärderades med omvänt transkriptas (RT-PCR) med användning av specifika primrar. Den positiva kontrollen bestod av IDO-uttryckande MC24-transfektanter och den negativa kontrollen bestod av håliga transfekterade MC 22- celler. Pixeltätheten för IDO-band normaliserades mot p-tubulin (p-tub). ( d ) IDO-proteinuttryck i DC-underuppsättningar efter 18 timmars stimulering med levande jästar eller hyfer, Zymosan (Zym), LPS, Glucan (Glu) eller Mannan (Man) (10 ng / ml) eller CpG-oligodeoxynukleotid (CpG-ODN) (2 μM). pDC: er, plasmacytoid PDCA-1 + DC fraktionerade från mjälten. Värdena är representativa för tre experiment.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Induktion av IDO i FL-DC genom den icke-kanoniska NF-KB-banan

Den icke-kanoniska NF-KB-vägen krävs för uttryck av Indo , 19, 20, en undertryckande mekanism för DC. 21, 22 Vi undersökte vilken NF-kB-aktiveringsväg som förmedlar IDO-proteinuttryck i någon av DC-delmängderna för att blockera den kanoniska eller icke-kanoniska vägen genom att tystna respektive IKKp eller IKKa med liten interferens RNA (siRNA). Bekräftelse av tidigare data, 2, 19 IDO-proteinuttryck inträffade i FL-DC, men inte i GM-DC, som svar på hyfer och var beroende av IKKa-aktivering (figur 2c). I själva verket verkade IDO starkt uttryckt av FL-DC som administrerades si-IKKp i frånvaro av stimulering. Dessa data, tillsammans med våra tidigare fynd som visade att IDO-uttryck i FL-DC var TRIF-beroende men MyD88-oberoende, 2 indikerar att IDO-aktivering i FL-DC sker genom den icke-kanoniska NF-kB-vägen.

Eftersom IDO induceras i plasmacytoid-dendritiska celler (pDC: er) genom en TLR9 / MyD88-beroende väg, 21 och FL-DC omfattar både inflammatoriska och pDC: er, utvärderar vi huruvida IDO-induktion i pDC: er kan redogöra för IDO-uttryck i FL-DC. I motsats till CpG-oligodeoxynukleotid (CpG-ODN) inducerades IDO inte i pDC av svampen, vilket antydde att Candida inte kanske interagerar direkt med pDC för IDO-proteininduktion. För att få insikt i de möjliga mekanismerna som ligger bakom IDO-aktivering bedömde vi immunreglerande svamppatogenassocierat molekylmönster (PAMP), såsom zymosan, glucan och mannan, och definierade TLR-ligander för IDO-induktion i DC. I likhet med hyfer inducerades IDO-uttrycket av lipopolysackarid och zymosan, men inte av glucan eller mannan, i FL-DC men inte i GM-DC eller pDC, vilket visar att aktiveringen av IDO i FL-DC är medierad av utvalda svampligander som verkar genom TLR4 och TLR2 (figur 2d).

Signalomvandlare och aktivator för transkription 3 reglerar det antiinflammatoriska / reglerande tillståndet för DC

Signalomvandlare och aktivator av transkription 3 (STAT3) är oumbärlig för FL-DC-utveckling och ontogeni, villkorar det tolerogena tillståndet för DC och fungerar som en negativ regulator av immunstimulerande DC. 23 Eftersom STAT3 aktiverar den icke-kanoniska NF-kB-vägen medan hämmar den kanoniska NF-kB-vägen, 24 bedömde vi om detta skulle inträffa som svar på svampar och effekten på IDO-aktivering. Vi mätte Tyr 705 fosforylering av STAT3, som främjar dess transkriptionsaktivitet, i GM-DC eller FL-DC och beroendet av MAPK, MyD88 och TRIF. STAT3-aktivering i GM-DC skedde inte före 12 timmars stimulering med Candida- jäst (figur 3a). Däremot STAT3-aktivering i hypha-pulserade FL-DC, vars basala nivåer av fosforylering var särskilt högre jämfört med den för GM-DC: er, toppade vid 3 timmar, hölls förhöjda vid 12 timmar (figur 3a) och var beroende av p38, men inte på ERK och på TRIF mer än MyD88 (figur 3b). STAT3-hämning med Tyrphostin AG490 (AG490) (figur 3d) och på liknande sätt med cucurbitacin I (JSI-124), en farmakologisk hämmare av Jak2 – STAT3-vägen (data visas inte), förbättrade aktiveringen av den kanoniska vägen i båda DC-delmängderna ( Figur 3c) men försämrade aktiveringen av den icke-kanoniska vägen i FL-DC (figur 3d). STAT3-hämning reducerade också kraftigt IDO-proteinuttryck i FL-DCs, på ett sätt liknande p38 MAPK-hämning (figur 3e). Tillsammans indikerar dessa data att STAT3-fosforylering som svar på hyfer är en proximal signalering för aktivering av icke-kanonisk NF-kB och IDO i FL-DC.

Aktivering av signalomvandlare och aktivator av transkription 3 (STAT3) i dendriticcell (DC) underuppsättningar av Candida albicans . ( a ) Fosforylering av STAT3 i GM-DC eller FL-DC, pulserat med jäst eller hyfer, ( b ) eller i hypha-pulserade FL-DC från myeloid differentieringsfaktor-88 (MyD88) - eller Toll / IL-1 receptor domän -innehållande adapter som inducerar IFN-beta (TRIF) - bristfälliga möss. I panel a bedömdes STAT3-fosforylering i hyfe-pulserade FL-DC med och utan närvaro av hämmare av STAT3 (Tyrphostin AG490 (AG490), 25 μM), p38 (SB202190, 5 μM) eller ERK (UO126, 15 μM). Blottar av celllysat inkuberades med polyklonalt Abs hos kanin som känner igen fosfo-STAT3 (Tyr705) följt av pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-kanin IgG. Kanonisk kärnfaktor-kappaB (NF-KB) aktivering med ( c ) elektroforetisk mobilitetsskiftanalys (EMSA) och ( d ) IkappaB kinase-beta (IKKp) eller IkappaB kinas-alfa (IKKa) fosforylering 90 minuter efter stimulering i närvaro av STAT3-hämmaren AG490. ( e ) Immunoblots av IDO i FL-DC vid 18 timmar efter stimulering i närvaro av AG490 eller SB202190. p-tub, p-tubulin.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

De intracellulära signalvägarna påverkar cytokinproduktion, mognad, och Notch-liganduttryck

Även om en omfattande analys av cytokin / kemokinproduktion av DC-undergrupper utförda med Bio-Plex (Bio-Rad Laboratories, Life Science Group, Segrate, Italien) rapporterades cytokinanalyser i kompletterande figur S2, i denna studie behandlade vi det relativa bidraget av varje signalväg på nivåerna av IL-12p70, IL-23, IL-10 och IL-4-produktion, på grund av det faktum att det relativa bidraget av dessa cytokiner till svampdämpande Th-polarisering är väl beskrivet. 1, 2, 5 Dessutom bedömde vi också typ I-interferon (IFN) och IL-27-produktion, med tanke på rollen som IFI-typ I på IDO-induktion 25 och den antiinflammatoriska egenskapen hos IL-27. 26 cytokiner utvärderades både med avseende på mRNA-uttryck och faktisk cytokinproduktion med endera typ av DC som svar på olika stimuli i närvaro av hämmare av ERK1 / 2, p38, JNK1 / 2, PI3K – Akt, STAT3 och kanonisk ( av si-IKKp) eller icke-kanonisk (av si-IKKa) NF-KB. Bekräftande tidigare data, 2 nivåer av p35 och p19 mRNA var högre i GM-DC vid jäst snarare än hyfe-stimulering, och nivåerna av Il10 var jämförbara, medan de för Il4 var högre med hyfer snarare än med jäststimulering. Däremot var nivåerna av Il10 , IL27p28 och Ifn-â högre i FL-DCs stimulerade med hyfer än med jäst, medan de för p35 var jämförbara och inget p19 mRNA kunde detekteras (figur 4a). Resultat med hämmare visade att cytokinproduktionen genom GM-DCs i stort sett var p38-oberoende och mestadels, men ändå, reglerad av ERK – JNK – PI3K och kanonisk NF-κB. Även om båda var beroende av kanonisk NF-KB, hämndes IL-12p70 av ERK och JNK, men IL-23 befordrades av ERK, JNK och PI3K. Däremot var IL-10 beroende av ERK och PI3K och var negativt reglerade av JNK, IL-4 var ERK-, JNK- och PI3K-beroende, och båda var i stort sett oberoende av kanonisk NF-KB. I FL-DC var produktionen av cytokiner i stort sett oberoende av ERK och var beroende av p38 och icke-kanonisk NF-kB (IL-12p70, IL-10 och IL-27) såväl som av STAT3 (IL-12p70 och IL-27). Intressant nog främjade hämningen av STAT3 och icke-kanonisk NF-KB IL-23-produktion i dessa celler (figur 4b). Experiment med Myd88 - / - DC eller Trif - / - DC: er bekräftade att cytokinproduktion med GM-DC var MyD88-beroende, medan den för FL-DC var mestadels (IL-12p70) eller helt (IL-10, IFN-p, och IL-27) TRIF-beroende (figur 4c). Dessa data indikerar att cytokinproduktion i GM-DC sker främst genom MyD88 och implicerar ERK – JNK – PI3K – Akt och kanonisk NF-κB signalering. Däremot reglerar TRIF-vägen väsentligen cytokinproduktion med FL-DC och implicerar p38, STAT3 och icke-kanonisk NF-KB signalering.

De intracellulära signalvägarna påverkar cytokinproduktion och mognad av dendriticcell (DC) undergrupper exponerade för Candida . Cytokiner utvärderades i termer av mRNA-expression med ( a ) omvänt transkriptas PCR (RT-PCR) eller ( b, c ) cytokinproduktion med ELISA av varje DC-underuppsättning ostimulerad (-) eller stimulerad med jäst eller hyfer (svarta och grå histogram, respektive) i närvaro av hämmare av extracellulära signalreglerade kinaser (ERK1 / 2), (U0126), p38 (SB202190), Jun N-terminala kinaser 1 och 2 (JNK1 / 2) (10 um, SP600125), fosfoinositid 3 -kinas (PI3K) –Akt (5 μM, Wortmannin), signalomvandlare och aktivator för transkription 3 (STAT3) (AG490), och kanonisk (si-IkappaB kinase-beta (IKKβ)) eller icke-kanonisk (si-IkappaB kinase-alpha (IKKa)) kärnfaktor-kappaB (NF-KB). ( d ) Expression av Notch-ligander i ostimulerade (-) eller Candida- stimulerade DC: er genom RT-PCR. Jag1 och Jag2 , Jagged1 och Jagged2 . * P <0, 05, pulsad kontra opulerad (-) DC; pulserade DC: er med och utan hämmare, och C57BL / 6 DC mot Myd88 - / - eller Trif - / - DC. Värdena är representativa för fem experiment.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

När det gäller mognad och costimuleringsmolekyluttryck uttryckte GM-DCs CD80 mer än CD86 på ett ERK-beroende sätt, medan FL-DC uttryckte CD86 och mognadsmarkören CD83 på ett p38-beroende sätt. Som costimulatoriska molekyler, kända för att vara involverade i Treg-aktivering av DC, såsom inducerbar costimulatorligand (ICOSL), glukokortikoidinducerad tumörnekrosfaktorreceptorligand (GITRL) och programmerad celldöd-1-ligand (PD-L1), inducerades inte i någon av DC-delmängderna (data visas inte), och med tanke på den viktiga rollen för Notch-liganderna, Delta 4 och Jagged 1 och 2, i att fastställa resultatet av immunreaktivitet, 27 bedömde vi uttrycket av Delta 4, Jagged 1 och 2 2 på DC-delmängder. Både Delta 4 och Jagged 2-uttryck uppreglerades i FLDC, medan uttrycket av Jagged 1 var uppreglerat i GM-DC (figur 4d). Eftersom uttrycket av Delta 4 i DC är förknippat med aktiveringen av IL-10-producerande Th1-celler och Jaggade 1 och 2-uttryck är variabelt involverade i induktionen av Th2 / Treg-celler, 27 dessa data skulle förutsäga att någon av DC-typerna undergrupper är behöriga för aktivering av distinkta adaptiva Th-svar in vivo .

Aktivering av distinkta intracellulära program i Peyers patch DC: er av Candida

För att definiera relevansen in vivo av ovanstående fynd, bedömde vi Peyers lappar (PP) -DC för signaltransduktionsvägar aktiverade som svar på jäst och hyfer, in vitro och in vivo . Liknar GM-DC: er, fosforylering av ERK och Akt och kanonisk NF-kB-aktivering inträffade i PP-DC pulserade in vitro med jäst, medan, liknande FL-DC, p38 fosforylering, aktivering av STAT3, icke-kanonisk IKKa och induktion av STAT3-beroende IDO-uttryck inträffade som svar på hyfer (figur 5a). Resultat från infekterade möss bekräftade in vitro- fynden och visade att IKKp-aktivering var, om än delvis, MyD88-beroende, medan STAT3- och IKKa-aktivering som svar på hyfer var TRIF-beroende (figur 5b). Eftersom IDO-aktivering i PP-DC som svar på hyfer in vivo också inträffade på ett TRIF-beroende sätt, 2 visar dessa data att STAT3 – icke-kanonisk NF-kB – IDO-vägen aktiveras i PP-DC av hyfer och i ERK – Akt – kanonisk NF-κB-väg genom jäst.

Distinkta intracellulära signalvägar aktiveras av jäst och hyfer i PP-DC. ( a ) Peyers lapp (PP) DC från naiva möss exponerades in vitro för levande oponiserade Candida- jästar (svarta histogram) eller hyfer (grå histogram) före bedömningen av extracellulära signalreglerade kinaser (ERK1 / 2), p38 mitogen-aktiverad proteinkinas (MAPK), Akt, signalomvandlare och aktivator av transkription 3 (STAT3), IkappaB-kinas-beta (IKKp) eller IkappaB-kinas-alfa (IKKa) fosforylering (30 min senare), och IDO-proteinuttryck (med och utan Tyrphostin AG490 (AG490), efter 18 timmars stimulering). ( b ) PP-DCs renades från naiv eller C57BL / 6-, myelojdifferentieringsfaktor-88 (MyD88) - eller Toll / IL-1-receptor-domäninnehållande adapter som inducerar IFN-beta (TRIF) -tillräckliga möss (en dag efter den intragastriska infektionen med 108 Vir-13- eller Vir-3-celler) och utvärderades omedelbart med avseende på STAT3, IKKp eller IKKa fosforylering. Data presenteras som immunoblott av celllysat med fosforyleringsspecifika antikroppar och vikningsökningar (pixeltäthet) i fosforylerade till totala proteinförhållanden eller till ß-tubulin (ß-tub). Representant för tre experiment.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

PP-DC aktiverar distinkta svampdödande Th / Treg-cellrespons in vivo

För att bedöma om de differentiella molekylprofilerna som framkallas i PP-DC: er översätter till distinkta adaptiva Th-svar in vivo analyserades jäst- eller hyfe-pulserade PP-DCs jämförelsevis med på samma sätt pulserade GM-DC eller FL-DC för deras förmåga att aktivera immunskydd hos möss med candidiasis. Figur 6a visar att PP-DC eller GM-DC pulserade med jäst främjade aktiveringen av Rorc + 17-producerande CD4 + T-celler och Gata3 + IL-4 / IL-10-producerande CD4 + T-celler med minimal aktivering av tbet + IFN -y-producerande celler, och detta resulterade i en begränsad kontroll av svamptillväxt.

Peyers DC-plåster (PP) aktiverar distinkta svamp mot Th-celler in vivo och dämpar inflammation i tarmen. ( a ) C57BL / 6-möss fick Candida - eller Zymosan (Zym) -pulserade DC två gånger, en veckas mellanrum, innan den intragastriska infektionen med svampen. Svamptillväxtkolonidannande enheter (CFU) i magen, Th-linjespecifika transkriptionsfaktorer och cytokinuttryck i CD4 + T-celler från mesenteriska lymfkörtlar med omvänt transkriptas (RT-PCR) bedömdes en vecka efter infektionen. * P <0, 05, DC-behandlade mot obehandlade (-) möss. C, kontrollera naiva möss. Värdena är representativa för tre experiment. ( b ) C57BL / 6-möss intragastriskt infekterade med svampen behandlades med 1 mg / kg cucurbitacin I (JSI-124) 3 dagar efter infektion och utvärderades med avseende på svamptillväxt och Th-specifika transkriptionsfaktorer som i panel a (grupp 2 och 3). Grupperna 4–7 avser möss behandlade med GM-DC eller FL-DC in vitro pulserade med jäst respektive hyfer i närvaro av JSI-124 (10 μM). * P <0, 05, behandlade mot obehandlade (-) möss och FL-DC med och utan JSI-124. ( c ), signalomvandlare och aktivator av fosforylering av transkription 3 (STAT3) i renade CD4 + T-celler eller CD11 + DC från de mesenteriska lymfkörtlarna hos möss behandlade (+) som i panel a. C, kontrollera naiva möss. ( d ) Jästpulserade GM-DC: er och hyfe-pulserade FL-DC: er eller PP-DC: er injicerades i svår kombinerad immunbristmöss (SCID)-möss 3 timmar före administrering av kolitogena CD4 + CD25 - T-celler från BALB / c-möss. Musvikt registrerades två gånger per vecka och möss dödades runt dag 60. Data är medelvärde ± se av möss i varje behandlingsgrupp ( n = 6) i ett representativt experiment av två. Cytokiner bestämdes i kolonhomogenater 9 veckor senare. * P <0, 05, FL-DC- eller PP-DC behandlade mot obehandlade (-, •) möss.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

I likhet med FL-DC, främjade hyfe-pulserade PP-DC aktivering av Th1 / Treg-celler, vilket indikerade aktiveringen av ett skyddande tolerogent svar på svampen som stod för kontrollen av svamptillväxt och långvarig överlevnad (figur 6a). Dessa data indikerar att distinkta signaltransduktionsvägar förmedlar den funktionella aktiviteten för DC in vivo . Detta bekräftades av resultaten med utvalda svamp PAMP. Zymosan, känd för att inducera både Th17 28 och Tregs, 29 aktiverade GM-DC för Th17-priming och FL-DC för Th1 / Treg-priming (figur 6a), medan mannan-pulserade GM-DC: er, som efterliknar hyfe-pulserade GM-DC, främjades aktiveringen av Gata3 + Th2-celler associerade med omfattande svamptillväxt (data visas inte). Dessa data antyder att inflammatoriska DC: er aktiverar och reglerande DC: er dämpar inflammatoriska svar på svampen och är i linje med fynden att inflammation dämpas i MyD88-bristande möss och befordras i TRIF-bristande möss, och att tolerogen IDO + DC återställer tolerans i annars intoleranta möss. 2, 11

Eftersom defekt STAT3 har kopplats till candidiasis, 30, 31, blockerade vi STAT3-aktivering vid infektion eller i Candida- pulserade DC före adoptiv överföring in vivo genom behandling med JSI124, en farmakologisk hämmare av Jak2 – STAT3-vägen. 32 Figur 6b visar att behandling med JSI-124 kraftigt ökade svamptillväxten i magen och aktiverade Rorc + men inte Tbet + eller Foxp3 + CD4 + T-celler i mesenteriska lymfkörtlar (MLN). Vid bedömning av vilka celltyper (T mot myeloida celler) som påverkades av JSI-124-behandling in vivo , försämrades STAT3-aktivering i CD11c + men inte i CD4 + T-celler (figur 6c), ett resultat i linje med uppfattningen att vid varians med T-celler främjar 30, 31 STAT3-brist i myeloida DCs inflammatoriska sjukdomar. 33 Såsom förutses av den ökade IL-23-produktionen (figur 4b) upphävde blockering av STAT3 kapaciteten hos FL-DC: er för att aktivera tolerogena svar på svampen och resulterade i Th17-cellaktivering (figur 6b). Tillsammans tyder dessa data på att STAT3-aktivering i myeloida celler krävs för förekomsten av tolerogena svar på svampen som slutligen påverkar den lokala Th17 / Treg-balansen.

Candida dämpar det inflammatoriska svaret i tarmen genom PP-DC

Upptäckten att STAT3-brist i myeloida celler orsakar Crohns sjukdomliknande patogenes och dödlighet, 33, 34 och IDO-induktion dämpar kolit 35 och förmedlar probiotisk funktionalitet, 36 ledde oss till hypotes om huruvida immunreglering av Candida genom PP-DC kan påverka inflammation i experimentell kolit. Vid adoptiv överföring i svår kombinerad immunbrist (SCID) -möss med CD4 + CD25 - T-cellinducerad kolit, Candida- pulserade PP-DC och FL-DC, men inte GM-DC, förhindrade viktminskning och återställde den inflammatoriska / anti -inflammatorisk cytokinbalans (figur 6c). Således kan tolerogena PP-DC: er tjäna den dubbla rollen för att inducera skyddande tolerans mot svampen - sannolikt gynna kommensalism - samt dämpa det lokala inflammatoriska svaret i tarmen.

Diskussion

C-typ lektinreceptorer, Dectin-1 37, 38, 39 och dendritisk cellspecifik intercellulär vidhäftningsmolekyl 3-gripande nonintegrin (DC-SIGN), 40 är kända för att reglera IL-10 och IL-12 produktion av DC som svar på Candida eller svamp PAMP, och att bidra till svampdödande immunitet och immunhostostas. 29, 41 En omfattande analys av det relativa bidraget från intracellulära signalvägar och / eller distinkta DC-underuppsättningar för att avkänna Candida morphotypes har emellertid inte rapporterats. I denna studie visar vi att balansen mellan distinkta signalvägar i DC: er översätter det TLR-beroende erkännandet av Candida morphotypes till distinkta adaptiva immunsvar in vivo genom de antagonistiska MyD88- och TRIF-vägarna (figur 7). ERK- c- fos konditionerade GM-DC: er både för Th2 och, tillsammans med JNK och PI3K – Akt, för Th17-priming, medan p38-vägen konditionerade FL-DC för Th1 / Treg-priming. TLR2 – MyD88-vägen förmedlade väsentligen aktiveringen av inflammatoriska GM-DC, medan TLR4 – TRIF-vägen var avgörande för aktiveringen av tolerogena FL-DC. Eftersom hyperfosforylering av c- Jun- och c- fos-transkriptionsfaktorer är känt för att mediera Th2-aktivering med DC: er, 13 det faktum att hyfer, mer än jästar, aktiverade reaktiva syrearter (ROS) i DC, 15 och att ihållande JNK-aktivering medieras av ROS, kan erbjuda en rimlig förklaring till den högre Th2-främjande aktiviteten hos hypha-pulserade DC: er.

Schema för förmodande signalvägar som redovisar specialisering och flexibilitet hos DC: er som presenterar Candida albicans . Figuren visar att balansen mellan distinkta signalvägar i DC: er översätter Toll-liknande receptor (TLR) beroende erkännande av Candida morphotypes till distinkta adaptiva immunsvar. IDO, 2, 3 indoleamindioxygenas. Se text för detaljer.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Vid varians med hyfer aktiverade jäst också GM-DC med Th17-polariserande kapacitet, såsom förutses av produktionen av IL-23 och IL-1P (kompletterande figur S2), varvid båda cytokiner krävdes för Th17-aktivering som svar på svampar. 42 Detta inträffade genom den TLR2 / MyD88-beroende aktiveringen av PI3K – Akt-vägen, känd för att undertrycka IL-12 och att främja IL-10 vid TLR2-aktivering av DC: er. 43 Upptäckten av att denna signalväg aktiverades, om än sent, som svar på hyfer antyder det eventuella bidraget av hyfer till IL-23-produktion av DC, som föreslog. 44 Glucan-pulserade GM-DC inducerade också Th17-cellaktivering in vivo (data visas inte), ett fynd som bekräftar bidraget från dectin-1-agonister till Th17-aktivering 45 och autoimmunitet. 41

I motsats till GM-DC, gynnade en långvarig p38 ett Th1 / Treg-resultat i FL-DCs stimulerade med hyfer, vilket bekräftar den avgörande rollen för p38-vägen i IL-12p70-produktion genom TLR4 och DC-mognad. 46 Således, snarare än att undanröja TLR4-signalering, såsom föreslogs med mononukleära celler, är 7, 8 Candida hyphae särskilt skickliga på att aktivera TLR4 – TRIF-vägen i DC, ett fynd som stöds av uppfattningen om ett differentiellt krav för TRIF – MyD88-signalvägar i aktivering av DC: s kontra makrofager. 16 I själva verket var produktionen av cytokiner associerade med tolerogena DC, nämligen IL-10, IFN-p och IL-27, strikt p38 / TRIF-beroende. I likhet med hyfer aktiverade zymosan det tolerogena programmet för FL-DC. Således kan zymosans förmåga att aktivera inflammatoriska och tolerogena DC: er erbjuda en trolig förklaring till den till synes motstridiga rollen för zymosan i immunaktivering, som är associerad med både Th17 28, 47 och Treg 29 -cellaktivering in vivo .

En viktig och ny observation av denna studie är STAT3: s bidrag till plasticiteten hos DC-undergrupper som svar på svampen. STAT3 aktiverades i FL-DC genom TRIF och p38, medierades nedströms genom icke-kanonisk NF-kB / IDO-aktivering, och inträffade troligen genom IL-10 / IL-10R autokrin slingan, hämmad på IL-10-blockad (data inte visas) och mindre genom IL-6-gp-130 – STAT3-vägen, eftersom IL-6-produktion i FL-DC inte uppenbarligen skilde sig mellan hyfer och jäst (kompletterande figur S2). Det är av intresse att glykogensyntas-kinas-3, känt för att gynna den nukleocytoplasmiska shuttlingen av STAT3, 48 också aktiverades mer i FL-DC än i GM-DC.

Emellertid antyder det sena STAT3-uttrycket i GM-DCs en möjlig tvåstegsmodell av aktivering, i vilken den sena aktiveringen av STAT3 / IL-10 genom proinflammatoriska stimuli kan tjäna till att begränsa aktiveringstillståndet för DC och att bidra till produktionen av IL-10 av Thl-celler. Upptäckten att STAT3 och den icke-kanoniska NF-KB-blockaden båda resulterade i IL-23-produktion ger bevis på bidraget från denna väg till interkonvertibiliteten mellan DC-undergrupper, vilket ytterligare bidrar till flexibiliteten och plasticiteten för DC-svar in vivo . I detta avseende är in vivo- data erhållna genom selektiv blockering av STAT3-aktivering i DC: er i linje med resultaten av en ökad mottaglighet för infektion hos patienter med defekt STAT3-aktivering. 30, 31 Men i överensstämmelse med den öppna autoimmuniteten som utvecklas i myeloidspecifika STAT3-bristande möss verkar 33 defekt tolerans vara en mekanism genom vilken candidiasis befordras under betingelser med STAT3-brist i myeloida celler. Även om underskottet i Th17 har tillskrivits känsligheten för candidiasis hos patienter med autosomalt dominerande hyper-IgE-syndrom och STAT3-brist, återstår 30, 31 huruvida DC-utveckling också är nedsatt hos dessa patienter.

Slutligen, upptäckten att PP-DC, liknande FL-DC, aktiverar det tolerogena programmet som svar på Candida hyphae och att båda DC-typer förbättrar kolit pekar på svampen som ett kommensal med lokala immunreglerande funktioner genom DC. Vi har bevis för att Candida- inducerade Tregs också förbättrar kolit genom omvänd signalering på PP-DC (manuskript under förberedelse). Detta skulle antyda att, liknande probiotika 36 men skiljer sig från Citrobacter rodentium , försvagas 49 dämpning av kolit av IDO + DC. Det faktum att mänskliga DC-underuppsättningar, liknande de murina motsvarigheterna, också aktiverar diskriminerande T-cell-svar på svampen (kompletterande figur S3) pekar på C. albicans som ett kommensal som kan balansera inflammation och tolerans på slemhinnor genom utnyttjande av intracellulär antagonistiska vägar i DC. I slutändan kan detta indikera en hög grad av samutveckling av däggdjursvärden och C. albicans och den resulterande symbiosen mellan de två.

metoder

Möss. Kvinnliga C57BL / 6, BALB / c och SCID-möss, 8–10 veckor gamla, köptes från Charles River (Calco, Italien). Homozygota Tlr2 - / -, Tlr4 - / -, Myd88 - / - och Trif - / - möss på C57BL / 6-bakgrund uppföddes under specifika patogenfria förhållanden på djurfaciliteten i Perugia University, Perugia, Italien. Experiment utfördes i enlighet med den italienska godkända djurskyddsförsäkringen A-3143-01.

Svampstammar och infektioner. Isogena stammar av C. albicans , erhållna genom mutagenes in vitro och kapabla (Vir-13) eller inte (Vir-3) av jäst-till-hyph-övergång, bestämda genom bakterierörsbildningen in vitro , användes. 2, 5 För hyfer tilläts celler att spira genom odling vid 37 ° C, i 5% CO2, under 2 timmar i RPMI 1640-medium (vid den tiden hade> 98% av cellerna grodd). För jäst skördades celler i slutet av den exponentiella tillväxtfasen. För infektion fick möss 108 Vir-13-celler intragastriskt och behandlades med JSI-124 (cucurbitacin I, från Tocris Bioscience, Bristol, Storbritannien) eller vehikelkontroll (DMSO) under 3 dagar, vid 1 mg / kg, en dos tidigare visat att inducera effektiva antitumoreffekter i. 32

Cellberedning och kultur. GM-DC eller FL-DC erhölls genom odling av benmärgsceller med 150 U / ml mus rGM-CSF (Sigma, St Louis, MO) och 75 U / ml rIL-4 (R&D Systems, Milan, Italien) i Iscove-medium kompletterat med glutamin, penicillin och streptomycin och 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum under 7 dagar eller 200 ng / ml FLT3-L (R&D Systems, Milan, Italien) under 9 dagar. 11 För det positiva urvalet av mPDCA-1 + pDC: er, fraktades CD11c + -celler med användning av mPDCA-1 MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland). Mer än 95% av mPDCA-1 + -cellerna färgades av markören 120G8. 11 PP-DC isolerades såsom beskrivits. 12 Hämmare av ERK1 / 2 (15 μM, U0126), p38 (5 μM, SB202190), JNK1 / 2 (10 μm, SP600125), PI3K – Akt (5 μM, Wortmannin; Sigma) och STAT3 (25 μM, AG490) köptes från Calbiochem (San Diego, CA) och upplöstes vid 1 000 x den slutliga koncentrationen i DMSO (Sigma). DC utsattes för hämmare i 120 minuter vid 37 ° C före stimulering. Kontrollceller behandlades med en identisk mängd DMSO. Stimuli inkluderade Zymosan (10 ng / ml) från Saccharomyces cerevisiae (Sigma), ultraren lipopolysackarid (10 ng / ml) från Salmonella minnesota Re 595 (Labogen Srl, Rho, Milan, Italien), cytosin-fosforotioat-guaninoligodeoxynukleotid (2) μM, CpG-ODN 1826, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), mannan från S. cerevisiae eller korn ß-glukan (båda vid 10 ng / ml, Sigma), levande jästar eller hyfer 11 i Iscove-medium kompletterat som ovan utan serum.

Adoptiv överföring av DC, svamputmaning och bedömning av skydd. Efter 2 timmars pulsering administrerades DC (5 x 105 ) intraperitonealt två gånger i 20 ul fosfatbuffrad saltlösning, med veckointervall, före infektionen. En vecka senare utvärderades möss med avseende på svamptillväxt och Th / Treg-cellaktivering genom omvänt transkriptas-PCR (RT-PCR) på renade (Miltenyi Biotec) CD4 + (> 98%) T-celler från dränering av mesenteriska lymfkörtlar.

Induktion av kolit. CD4 + CD25 - T-celler (3 x 105), renade från MLN av BALB / c-möss (Miltenyi Biotec), överfördes intraperitonealt till SCID-möss 3 timmar efter den intraperitoneala injektionen av 3 x 105 Candida- pulserade GM-DC, FL-DC eller PP-DC. Mössen övervakades sedan en eller två gånger i veckan för viktminskning, lös avföring, blodig diarré och rektal prolaps. 50 kolonhomogenat erhölls från kollagenas (1 mg / ml, Clostridiopeptidas A, Sigma) och DNas (5 ug / ml, Boehringher Mannheim, Mannheim, Tyskland) -behandlade kolon.

Western blotting. Proteinfosforylering bedömdes på celllysat som inkuberades med polyklonal Abs hos kanin, igenkänna den icke-fosforylerade formen av ERK, p38, JNK, Akt, STAT3 eller fosfop44 / p42 ERK (Thr202 / Tyr294), fosfo-p38 (Thr180 / tyr182), fosfo-SAPK / JNK (Thr 183 / Tyr185), phospho-Akt (Ser 473) och fosfo-STAT3 (Tyr705) följt av pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-mus eller anti-kanin IgG enligt tillverkarens instruktioner (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Blots utvecklades med användning av Enhanced Chemiluminescence detektionskit (Amersham Pharmacia Biotech, Milan, Italien). Immunoblotting för IDO utfördes med polyklonal IDO-specifik antikropp från kanin på DC efter 18 timmars stimulering. 2 Den positiva kontrollen bestod av IDO-uttryckande MC 24- transfektanter, och den negativa kontrollen bestod av håliga transfekterade MC 22- celler. Scanning densitometry utfördes på en Scion Image-apparat (Scion Corporation, MD). Pixeltätheten för band normaliserades mot totala proteiner eller p-tubulin.

Kanonisk och icke-kanonisk NF-kB. För analyser av elektroforetisk mobilitetsförskjutning märktes den dubbelsträngade sonden som innehöll ett NF-KB-konsensusställe 5-agttgaggggactttcccaggc-3-terminalt med T4-polynukleotidkinas 3'-fosfatas (PNK). Den experimentella reaktionen med den elektroforetiska rörlighetsskiftanalysens experimentella reaktion innehöll 10 μg nukleära extrakt, 2 μg icke-specifik konkurrent poly (dI-dC) och 200 ng enkelsträngad oligonukleotid. Bindningsreaktionsblandningen framställdes med 50 000 cpm (40 fmol) radiomärkt sond under 20 minuter i 20 m M 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) (pH 7, 6), 100 m M NaCl, 1 m M ditiotreitol, 1 m M fenylmetansulfonylfluorid eller fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 x fullständig proteasinhibitorblandning (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) och 5% glycerol. Komplex upplöstes på en 6% nativ polyakrylamidgel under 120 minuter vid 170 V i Tris-borat-EDTA (TBE) 0, 5 x. Efter elektrofores torkades gelén och bearbetades för autoradiografi. För bandspecificitet inkuberades de nukleära extrakten med antikropparna mot p65 och p50 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) under 45 minuter vid 4 ° C innan sonden tillsattes. Anti-phospho – IKKα (Ser180) / IKKβ (Ser181) kanin Abs (Cell Signaling Technology) användes för den västra blotting av fosfor IKKα och IKKβ.

siRNA-syntes och transfektion. siRNA utfördes för att rikta IKKa och IKKp såsom beskrivits. 19 siRNA-sekvenserna specifika för mus IKK ß (alias Ikbkb ; sense, 5, -GGUGCAUUCAUUAUCUUAAtt-3 ′; antisense, 5′-UUAAGAUAAUGAAUGCACCtg-3 ′) eller IKK α (alias Chuk ; sense, 5AUUGA; antisense, 5'-GAGAACCUGUAUUUAUUCCtg-3 ') valdes, syntetiserades och glödgades av tillverkaren och användes i kombination med en negativ kontroll-siRNA (Ambion, Austin, TX). DOTAP (Sigma) (1, 2 dioleolyl-3-trimetylammonium-propan) -medierad transfektion med 6, 7 μg siRNA utfördes såsom beskrivits genom att inkubera 106 DC i 20 timmar vid 37 ° C. 19 celler återvanns sedan, tvättades och användes omedelbart. Uttryck av IKKa- och IKKp-transkript i transfekterade eller håliga transfekterade celler (dvs. celler behandlade med DOTAP enbart) utvärderades med RT-PCR med användning av specifika primrar. 19

Enzymbunden immunosorbentanalys och omvänt transkriptas-PCR och realtids-PCR. Nivåerna av cytokiner i kolonhomogenat och kultursupernatanter (24 timmar) av DC eller renade MLN CD4 + T-celler från möss med kolit bestämdes med Kit-enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) (FoU-system). RT-PCR i realtid utfördes med användning av iCycler iQ detekteringssystem (Bio-Rad Laboratories, Life Science Group, Segrate, Italien) och SYBR Green kemi (Finnzymes Oy, Espoo, Finland). Celler lyserades och totalt RNA extraherades med användning av RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Milan, Italien) och omvänd-transkriberades med Sensiscript Reverse Transcriptase (QIAGEN) enligt tillverkarens anvisningar. PCR-primrarna var såsom beskrivits 2 eller enligt följande: framåt-primer: 5'-CCCTATGGAGATGACGGAGA-3 'och omvänd primer: 5'-CTGTCTGCTGGTGGAGTTCA-3' för Ifnb1 ; främre primer: 5′-GGACAAGGAGGAAGAGGAAGAG-3 ′ och omvänd primer: 5′-CGAACAGCCCGAGACAGG-3 ′ för IL-27p28; främre primer: 5′-ACCTTGACCTGTGCGGACTC-3 ′ och omvänd primer: 5′-GTTCGGCTTGGACCTCTGTTC-3 ′ för Delta4 ; främre primer: 5′-GTGGCTTGGGTCTGTTGCTTGG-3 ′ och bakre primer: 5′-CCGTGTTGGCTCCGTGTTTCTCG-3 ′ för Jagged1 ; fram primer: 5′-TGTGACGATGGCTGGAAGGG-3 ′ och omvänd primer: 5′-GCTGCTGTTCTTGGCGATGG-3 ′ för Jagged 2 . Amplifieringseffektiviteten validerades och normaliserades mot Gapdh . Den termiska profilen för SYBR Grön realtids-PCR var vid 95 ° C under 3 minuter, följt av 40 cykler av denaturering under 30 s vid 95 ° C och ett glödgnings- / förlängningssteg på 30 s vid 60 ° C. Varje datapunkt undersöktes för integritet genom analys av amplifieringsplottet. De mRNA-normaliserade data uttrycktes som relativt cytokin-mRNA i stimulerade celler jämfört med de från håravfallsmittade celler.

Statistisk analys. Data analyserades med GraphPad Prism 4.03-programmet (GraphPad Software, San Diego, CA). Studentens t- test eller variansanalys (ANOVA) och Bonferronis test användes för att bestämma den statistiska betydelsen av skillnader i organklaring och in vitro- analyser. Betydelse definierades som P <0, 05. De rapporterade uppgifterna är antingen från ett representativt experiment av tre till fem oberoende experiment (Western blotting och RT-PCR) eller på annat sätt samlas från tre till fem experiment. Grupperna in vivo bestod av sex till åtta möss per grupp.

Avslöjande

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur S1

  2. 2.

    Kompletterande figur S2

  3. 3.

    Kompletterande figur S3

    TILLÄGGSMATERIAL är länkat till onlineversionen av tidningen på //www.nature.com/mi