En balans mellan membranelasticitet och polymerisationsenergi sätter formen på sfäriska klatrinbeläggningar | naturkommunikation

En balans mellan membranelasticitet och polymerisationsenergi sätter formen på sfäriska klatrinbeläggningar | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • endocytos
  • Membranbiofysik
  • Membranproteiner
  • Multivesikulära kroppar

Abstrakt

Vid endocytos är byggnadsställningar en av mekanismerna för att skapa membrankurvatur genom att forma membranet till den sfäriska formen av clathrinburet. Påverkan av membranelastiska parametrar på montering och form av clathringitter har emellertid aldrig utvärderats experimentellt. Här visar vi att membranspänning motsätter sig klathrinpolymerisation. Vi rekonstituerar clathrin-spirande in vitro med jätte unilamellära vesiklar (GUV), renade adapters och clathrin. Genom att ändra de osmotiska förhållandena finner vi att klatrinbeläggningar orsakar omfattande spirande av GUV under låg membranspänning medan polymerisation till grunda gropar under måttlig spänning. Högspänning hämmar polymerisationen fullständigt. Teoretiskt förutspår vi spänningsvärdena för vilka övergångar mellan olika clathrinbeläggningsformer inträffar. Vi mäter förändringarna i membranspänning under clathrinpolymerisation och använder vårt teoretiska ramverk för att uppskatta polymerisationsenergin från dessa data. Våra resultat visar att membranspänningen kontrollerar klathrinmedierad spirning genom att variera membranens spirande energi.

Introduktion

Knoppning av sfäriska vesiklar är viktigt för membranhandel. Clathrin var det första proteinet som visade sig vara involverat i denna process 1, 2 . Clathrin polymeriserar till trunkerade icosahedrala burar in vitro 3 och deformerar tillsammans med olika partner 4 membranet till en sfärisk knopp 5, 6, 7 . Bland de mekanismer som är involverade i knoppbildningen har amfipatiska insättningar, som fungerar som kil för att skapa krökning, och trängningseffekten 8 av proteiner som binder asymmetriskt till membranet undersökts. Tvärtom föreslogs clathrin att agera genom ställning, vilket innebär att ett proteinbelägg med en viss form tvingar membranet till kurva 4 . Strukturen för den minsta clathrinburen är känd i detalj 9, 10, 11 . Clathrin bildar emellertid också platta hexagonala gitter vid plasmamembranet i cellerna 12 och sfäriska belagda vesiklar av olika storlekar, från 35 till 200 nm, i olika organismer 13 . Denna variation i storlek och form har ifrågasatt den ursprungligen föreslagna membranställningsmekanismen baserad på clathrinpolymerisation.

Clathrin binder membran genom en mängd olika adaptrar inklusive adaptinproteinkomplex (AP-1, AP-2, AP-3 och AP-4), AP180 / CALM, GGA och Hrs 14 . Adaptrar är specifika för undergrupper av klathrinmedierade membrantrafikvägar. I synnerhet har AP180 en hög förmåga att polymerisera clathrin in vitro och bildar mindre clathrinburar än klathrin enbart 15 . AP180 har en ANTH-domän som binder fosfatidylinositol 4, 5-bisfosfat (PIP 2 ) 5 . Det bildar emellertid grunt gropar när det rekonstitueras på lipidmonolag 5 och knoppar inte membranet hos stora unilamellära vesiklar (LUV: er). Dessa resultat antydde att clathrinpolymerisationsenergi inte var den dominerande faktorn för att kontrollera formen på clathrinbeläggningar.

Tvärtom, underlättar epsin 16, en klathrinadapter som strukturellt liknar AP180, klathrinaggregatet på membran till mycket böjda belagda knoppar 17 . Även om den är mindre potent vid klathrinpolymerisation har epsin en ENTH-domän som innehåller en amfipatisk spiral-0 som kilar sig in i den yttre membranbroschyren, vilket hjälper till att bygga upp krökning 17 Detta stöder den direkta rollen för adaptrar i generering av krökning.

Lipidmembran är deformerbara, flytande ytor 18 . För att deformera ett membran genom ställning måste den energiska förstärkningen vid beläggningspolymerisation vara åtminstone lika med de energikostnader som är förknippade med membrandeformation. Clathrinpolymerisationsenergin har aldrig jämförts med membran spirande energi. Detta beror på knoppens membranspänning, stelhet och geometri. Vi ifrågasatte alltså hur parametrar för membranelasticitet (det vill säga spänning och styvhet) kan påverka clathrinpolymerisation.

Resultat

Membranspänning motsätter sig clathrinpolymerisation

För att studera mekanismen genom vilken clathrin deformerar membranet rekonstituerade vi klathrinbeläggningar på jätte unilamellära vesiklar (GUV: er, 5-50 mikrometer). Vi använde GUV: er innehållande 30% 1, 2-dioleoyl- sn- glycero-3-fosfoserin (DOPS) och 10% PIP 2 (se Metoder), som efterliknade sammansättningen av den inre plasmamembranbroschyren. Användningen av 10% PIP 2, fastän högre än fysiologisk koncentration, användes för att utesluta affinitetsskillnader mellan adaptrar. Dessutom förblir den fysiologiska koncentrationen av PIP 2 i en klathrinbelagd grop okänd. GUV: er märkta med 1% tetra-metylrododamin (TMR) -PIP 2 inkuberades med 0, 5 μM renad AP180 och 0, 4 μM renad clathrin innehållande 20 mol% Alexa Fluor 488-märkt clathrin (AF488-Clathrin) (se metoder) . Som förväntat var clathrin bundet till GUV: er endast i närvaro av AP180-adaptern (fig. La, b) och hjärnans PIP 2 (kompletterande fig. 1). Efter bindning av klatrin framträdde klathrin som en homogen fläck och kolokaliserades med membransignalen (fig. Ib). Clathrin bildade en fast beläggning, såsom visas genom frånvaro av återhämtning av fluorescens hos skiktet efter fotblekning (fig. 1c). Därefter studerade vi submikronstrukturen hos clathrinbeläggningen med hjälp av negativfärgad elektronmikroskopi (EM) av klatrinbelagda LUV: er. Som tidigare rapporterats 5, 6 observerade vi i de flesta fall små (några tiotals nm), clathrin-aggregat (Fig. 1d, e och 2e; Kompletterande Fig. 2) som täcker LUV: s yta. Djupet hos dessa clathrin-gropar var svårt att hantera med negativa fläckar, även om många av dem verkade ganska grunt (fig. 1e). Dessutom behöll LUV: erna sin runda form konsekvent med våra konfokala bilder av icke-deformerade GUV: er. Det är viktigt att alla observerade strukturer hade begränsat djup (se fig. 1c och inlägget i fig. 2e, isotonisk; kompletterande fig. 2). Eftersom clathrin / AP180 bildar starkt böjda burar in vitro i frånvaro av membran 15, antog vi att den kombinerade effekten av spänning och böjstyvhet var ansvarig för försämringen av full spirande genom att motsätta sig clathrin-polymerisationsenergin.

Image

( a ) GUV: er märkta med 1 mol% TMR-PIP 2 (röd) inkuberade med AF488-clathrin enbart (grönt) under 5 minuter. ( b ) Samma förhållanden som i en men med AP180 / AF488-clathrin. ( c ) Fluorescensåtervinning efter fotoblekningsexperiment av AF488-clathrinbeläggningen på membranet (se text). Skalstänger, 5 μm ( a - c ). ( d, e ) TEM-mikrografer av GUV: er belagda med clathrin (skalstänger, 200 nm ( d ) och 100 nm ( e )). ( f ) GUV: er märkta med TMR-PIP 2 (röd) inkuberades med AP180 / AF488-clathrin under tre osmotiska tillstånd: hypotonisk (hypo), isotonisk (iso) och hypertonisk (hyper). Skala bar, 5 μm. ( g ) Genomsnittlig fluorescensintensitet för klatrinbindningen (se metoder) för varje osmotiskt tillstånd, med se (*** P <0, 0001 i t- test). ( h ) Statistik över vesikelutseende (stor, liten eller ingen deformation) för de tre osmotiska tillstånden. ( i ) GUV: er märkta med TMR-PIP 2 (röd) inkuberades med AF488-AP180 under olika osmotiska förhållanden - hypoton (hypo), isotonic (iso) och hypertonic (hyper). Skala bar, 5 μm. För alla fluorescensförsök, n = 30–45 under varje tillstånd från minst tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

Image

( a ) Hypotoniska förhållanden. Skala staplar, 1 μm (övre raden) och 200 nm (nedre raden). ( b ) Isotoniska förhållanden. Skalstång, 200 nm. ( c ) Hypertoniska tillstånd. Skala staplar, 1 μm (övre raden) och 200 nm (nedre raden). ( d ) Statistik över GUV: s utseende observerad av TEM under olika förhållanden. ( e ) Mikrografer av clathringitter under isotoniska förhållanden (skalstång, 200 nm) med en högförstoringsbild (skalstång, 100 nm (botten)) och ( f ) mikrografer av klathringitter under hypertoniska förhållanden som visar tabulering av membranet ( skalfält, 200 nm) med en hög förstoringsbild (inlägg, skalfält, 100 nm). För elektronmikroskopiexperiment, n = 372 (hypoton), n = 54 (isotonic) och n = 134 (hypertonic) från minst tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

För att bekräfta om förändringar i membranspänning påverkade polymerisationen av klathrin överförde vi GUV: er gjorda i 208 ± 1 mOsm sackaroslösning till en clathrin / AP180-lösning med varierande osmolaritet. Vi undersökte klathrinpolymerisation på GUV under hypotoniska (180 ± 1 mOsm), isotoniska (208 ± 1 mOsm) och hypertoniska (236 ± 1 mOsm) externa buffertbetingelser. Under isotoniska förhållanden observerades inga optiskt synliga deformationer av GUV: er (fig. 1f, h). Vi observerade att GUV: er under hypotoniska tillstånd inte tillät AP180 / clathrin-bindning i de flesta fall (fig. 1f, g). Vi observerade att fluorescerande AP180 var effektivt bindande under alla osmotiska förhållanden (fig. 1i) med samma densitet (se kompletterande fig. 3), även i närvaro av clathrin. Vidare förändrades bindningen av den terminala domänen av clathrin (clathrin TD) till AP180 inte signifikant med förändringen av osmotiska tillstånd (kompletterande figur 4). Vi drog således slutsatsen att ökad membranspänning helt kunde försämra clathrinpolymerisation. Eftersom ytdensiteten för AP180 inte förändrades i närvaro av clathrin (se kompletterande figur 3), och eftersom ingen deformation av membranet observerades i närvaro av 0, 5 μM AP180 ensam under alla osmotiska förhållanden, drog vi slutsatsen att proteinmängd hade bara en försumbar effekt, om någon. Medan den använda 10% PIP 2 -koncentrationen tillhandahåller mer än tillräckligt bindningsställen för att inducera membrandeformation genom trängsel, är den låga affiniteten för AP180 ANTH-domänen för PIP 2 (några mikromololar, se ref. 5) och den låga AP180-koncentrationen i vår analys innebar att inte alla bindande platser var upptagna. Detta står för frånvaron av membrandeformation medierad av AP180-trängsel.

Påfallande ökade både klathrin- och membranfluorescenssignaler starkt under hypertoniska förhållanden (fig. 1f, g). I många fall härstammade långa, mycket belagda membranrör från GUV: erna, vilket antydde att under hypertoniska förhållanden kunde membranet deformeras kraftigt av clathrinbeläggningen (fig. 1f). Vi observerade också fem gånger mer deformerade GUV: er under hypertoniska förhållanden än i något annat osmotiskt tillstånd (fig. 1h). Dessa deformationer föreföll några minuter efter klathrin-tillsats (se kompletterande figur 5a), vilket var i överensstämmelse med tiden det tog att mätta membranet med klatrin. AF488-clathrin / AP180-belagda GUV: er under isotoniska förhållanden visade inte mer deformation när de utsattes för hypertonisk chock (kompletterande fig. 5b). Dessa resultat stöder vår hypotes om att GUV-deformation var ett resultat av klathrinpolymerisation.

För att bättre karakterisera formen på membrandeformationerna fixerades GUV: er som inkuberades med AP180 / clathrin under varierande osmotiska förhållanden för tunn-sektions elektronmikroskopi (TEM, se metoder). I likhet med de konfokala bilderna avslöjade TEM också obelagda membran när GUV: er inkuberades med proteiner under hypotoniska förhållanden (Fig. 2a, d). GUV: er som inkuberades under isotoniska förhållanden avslöjade en elektronstät beläggning som inte orsakade observerbara deformationer hos membranet (Fig. 2b, d). Vidare förblev LUV: er inkuberade med AP180 / clathrin under isotoniska förhållanden (se fig. 2e) rundformade, sett av EM med negativ färg. På dessa bilder (se även kompletterande figur 2) täcktes LUV: s yta med begränsade sammansättningar av clathrin, vilket bekräftade att den elektron-täta beläggningen som TEM såg verkligen var en riktig klatrinbeläggning. Dessa bilder visar emellertid att snarare än ett rent hexagonalt plattgitter bestod clathrinbeläggningen av tätt packade grunt knoppar på membranet (se fig. 1d, e och kompletterande fig. 2, monolager och isotonisk). Slutligen uppvisade GUV: er som inkuberades under hypertoniska förhållanden en helt knoppad yta täckt med ett elektronstätt skikt (fig. 2c, d). Belagda membranknoppar observerades med en medeldiameter av 65 ± 5 nm, nära värden av in vitro- bildade AP180 / clathrinburar 15 . Vidare, när LUV: er inkuberades under hypertoniska förhållanden i närvaro av AP180 / clathrin, visade många LUV: er en yta helt belagd med clathrinknoppar och långa rörformiga förlängningar täckta med många djupa knoppar (se fig. 2e; kompletterande fig. 2, hypertoniska). Sammanfattningsvis var observationer gjorda av EM (både TEM och negativ fläck) i överensstämmelse med våra konfokala mikroskopidata (fig. 1) och bekräftade att AP180 och clathrin kan deformera membranet på ett membranspänningsberoende sätt.

Membranelastisk energi mot clathrinpolymerisationsenergi

För att testa vår hypotes kvantitativt utvecklade vi en teoretisk modell som beskriver konkurrensen mellan clathrinpolymerisation, som gynnar fullständig knoppning, membranspänning och styvhet, som gynnar plana membran, för att förutsäga övergångar mellan olika möjliga knoppformer (se fig. 3a). I modellen är ett plant membran med spänning σ , och böjstyvhet K , i kontakt med en clathrin / AP180-lösning vid fasta koncentrationer. Vi betecknade med μ den fria energivinsten förknippad med polymerisationen av ett enhetsområde av clathrinbeläggning. Eftersom membranbundna clathrinbeläggningar är mycket styva (böjstyvhet c ≃ 300 k B T 19 ) antog vi att clathrin alltid polymeriserar till sfärer med fast radie rc . I vår modell kan spänningen inte modifiera pälsens radie, men den kan begränsa clathrinpolymerisation till partiella knoppar, såsom illustreras i fig. 3a, b. Följaktligen beaktar vår modell fyra möjliga knopptillstånd illustrerade i fig 3a: (1) naket membran: clathrin kan inte polymerisera, och membranet förblir obestruket; (2) grund partiell knopp: clathrin polymeriseras delvis i knoppar som är mindre än en halv sfär; (3) djup partiell knopp: clathrin polymeriseras till en knopp som är mer än en halv sfär men mindre än en full sfär och (4) full knopp: en full sfärisk klatrinbeläggning bildas runt membranknoppen. Denna beläggning korsas av en liten membranbindning med försumbar energi 20 som förbinder membranknoppen till huvudmembranet. Denna koppling är den enda skillnaden mellan våra fulla knoppar och fria klatrinbelagda vesiklar.

Image

( a ) De fyra möjliga tillstånden för en enda knopp som beaktas i modellen: naket membran (ingen bindning av clathrin), grund delvis knoppning, djup partiell knoppning och full knoppning (vilket ger en sluten knopp). Parameterisering av knoppen visas på den djupa partiella knoppen som diskuteras i texten. ( b ) Vår matematiska modell förutsäger tillståndet hos ett membran tätt packat med sammanhängande knoppar. Vår montering av modellparametrarna (se huvudtexten) förutspår ett knoppdjup ≃ 2 nm. ( c ) Fasdiagram förutsagt av vår modell, som visar det förutsagda spirande tillståndet som en funktion av den skalade spänningen och polymerisationsenergin (logaritmisk plot). ( d ) Experimentell uppsättning för mätning av clathrinpolymerisationsenergin: OT, optisk pincett; GUV, jätte unilamellär vesikel. ( e ) Konfokala bilder av AF488-clathrin och TMR-PIP 2- kanal (högerbilder) före och efter clathrininjektion (inverterad kontrast). Skala bar, 10 μm. ( f ) Diagram som visar rörkraft mot tid under tillsats av klathrin. ( g ) Tredimensionellt fasdiagram med experimentella data från e och f (linjär plot). Clathrin-polymerisationsenergin mättes från 15 oberoende experiment.

Bild i full storlek

Denna beskrivning överensstämmer med de partiella beläggningarna som observerats med negativfärgad EM (Fig. 2e; Kompletterande Fig. 2). För att stödja denna geometriska bild mätte vi den genomsnittliga storleken på partiella knoppar odlade på glimmer-stödda tvåskikt med atomkraftsmikroskopi för att hitta en höjd av 15–20 nm och en diameter på 80–100 nm (se tilläggsfiguren 6). Subtraherar clathrinbeläggningens tjocklek ~ 15 nm, och dessa mätningar överensstämmer med membranknoppar med en radie av ~ 30 nm och ett djup på några nanometer såsom illustreras i fig 3b. Denna modell överensstämmer också med våra EM-studier, där vi observerade nakna membran under hypotoniska förhållanden (fig. 2a), grunt knoppar under isotoniska förhållanden (fig. 2a, e) och djupa knoppar under hypertoniska förhållanden (fig. 2a, f). Dessa iakttagelser stöder vårt antagande att AP180 / clathrin mestadels polymeriserar med en ungefär konstant krökningsradie rc . Från våra TEM-bilder under hypertoniska förhållanden (se ovan och fig. 2) drog vi således slutsatsen att r c = 32, 5 nm.

I modellen sönderdelade vi polymerisationsenergin för clathrin i två bidrag;

Image

, där μ 0 är den (positiva) klatrinbindande fria energin och

Image

, kostnaden för att böja membranet i en knopp. Dessutom introducerade vi pälsens linjespänning τ och beskrev de energikostnaderna för trasiga clathrin – clathrinbindningar vid gränsen för en partiell knopp. Detta leder till följande uttryck för den fria energin från en enda knopp:

Image

där A m och Ac är membran- och beläggningsområdena, förknippade med en knopp, och L är längden på dess kant (fig. 3a). I detta uttryck är μ dimensionellt ekvivalent med en kraft per enhetslängd och representerar nettokraften som en clathrinbeläggning applicerar på membranet under polymerisation. Membranspänningen σ och böjstyvheten κ motsätter sig denna kraft, medan kappans linjespänning τ gynnar knoppar med korta fälgar. För att göra förutsägelser på liposomnivå, använde vi detta teoretiska ramverk på en tät packning av belagda knoppar (se fig. 3b och kompletterande diskussion). Beroende på värdet på parametrarna kan vi analytiskt förutsäga formen på clathrinknopparna (nakna membranet, grunt / djupa partiknoppar eller fulla knoppar) som visas i fasdiagrammet Fig. 3c. Kvalitativt, för låg klathrinpolymerisationsenergi ( μ ≤2 τ / r c ), är membranet antingen naket för höga spänningar ( σ > μ ) eller helt knoppat om σ ≤ μ . Dessa två regimer finns fortfarande vid höga polymerisationsenergier ( μ > 2 t / r c ), men med den extra möjligheten till partiella knoppar vid måttliga spänningar. Denna energisituation med hög polymerisation återger våra observationer ovan av GUV under olika osmotiska förhållanden. Vi observerade ingen polymerisation för höga spänningar och full spirande för låga spänningar. Dessutom observerar vi inte rent hexagonala gitter (se fig. 2, och även kompletterande fig. 2), och tolkar således den kontinuerliga fluorescerande färgningen av clathrin på GUV: er (fig. 1) under isotoniska förhållanden som en tät täckning av sammanhängande grunt knoppar (se fig. 1e och 3b).

För att validera vår modell, mätte vi membranspänning σ och clathrin-polymerisationsenergi μ Vi använde en in vitro mikromanipuleringsanalys (se fig. 3d) 21 för att dra ut en membran-nanorör från GUV: er med hjälp av en streptavidin-pärla som hölls i optisk pincett. Vi modulerade membranspänningen σ genom att suga GUV i en mikropipett. Denna teknik tillät oss att kvantifiera och kontrollera spänningar på ett sätt som inte kan uppnås genom osmotisk chock. Vi mätte kraften F som krävs för att upprätthålla röret med hjälp av optisk pincett. I frånvaro av clathrin ges denna kraft av 22

Image

, vilket gör att vi kan mäta 23 membranböjningsmodulen κ = 13 ± 5 k B T. När röret formades injicerades en blandning av AP180 och AF488-clathrin i isotonisk buffert med användning av en andra mikropipett (se Metoder och fig. 3d). Clathrin-bindning observerades längs membranröret och på GUV-ytan. Clathrin GUV-färgning var homogen (fig. 3e), i överensstämmelse med bildningen av ett kontinuerligt platt skikt som i fig. La, b. Efter klathrinpolymerisation observerade vi en reduktion av den totala uppenbara GUV-membranarean i 87% av alla experiment, i överensstämmelse med sekstreringen av membranet till klatrinbelagda gropar (se fig. 3d, f; kompletterande tabell 1). 6% reduktion av det uppenbara GUV-området (se tilläggstabell 1) gjorde det möjligt för oss att beräkna ett genomsnittligt knoppdjup på 2 nm, vilket överensstämmer med våra EM-data. Under clathrinpolymerisation på GUV och röret mätte vi ett fall i rörkraften (se fig. 3f). AP180 ensam inducerade inte ett signifikant kraftfall vid bindning till rören (se kompletterande figur 7). I de fall där det uppenbara membranområdet minskade, använde vi vår matematiska modell för att sluta värdena på parametrarna μ och τ från minskningen av det uppenbara membranområdet och rörkraften (Kompletterande diskussion). De resulterande värdena anges i kompletterande tabell 1 och betecknas med hela cirklar i fasdiagrammet i fig. 3g (färgkod identisk med fig. 3c). I alla fall föll de uppmätta värdena på μ och σ i den grunda knoppregimen, vilket bekräftar vår hypotes om att kontinuerlig färgning av klathrinbelagda GUV under isotoniska förhållanden verkligen var sammanhängande grunt knoppar. Det uppmätta värdet av clathrinpolymerisationsenergin per enhetsyta var lika med 7, 6 ± 5, 4 × 10 −5 Nm −1, med μ 0 = 1, 0 ± 0, 5 × 10 −4 Nm −1 . Vi hittade τ = 5, 2 ± 7, 4 × 10 −2 pN, långt under värden där linjespänningen kan knoppa membrandomäner på egen hand (vanligtvis 1 pN, se ref. 24). Detta stöder vår hypotes om att membranböjning främst beror på clathrinpolymerisation och inte på linjespänningen.

Clathrin-polymerisationsenergin är summan av två bidrag: clathrin – clathrin-interaktioner och clathrin-membraninteraktioner medierade av adaptrar, som vi uttrycker som μ 0 = μ c − c + μ c − m . I byggnadsställningsmekanismen är clathrin-polymerisation den främsta drivkraften för membrandeformation, vilket antyder att μ c − c är mycket större än μ c − m . För att testa denna modell uppskattade vi den relativa vikten av μ c − c och μ c − m genom att mäta kraften som krävs för att sprida klathrinbeläggningen. Vi aspirerade klathrinbelagd GUV med hjälp av en mikropipett med radie Rp ≃ 1 μm (fig. 4a) under isotoniska förhållanden. För måttliga tryck behöll vesikeln sin sfäriska form då skiktet förhindrade deformation av membranet. Efter att öka aspirationstrycket över ΔPc = 231 ± 26 Pa observerade vi ett plötsligt brott i pälsen längs kanten på pipetten följt av markerad membranstångförlängning (Fig. 4a, b). De resulterande sprickorna i beläggningen var synliga både under ett förlängt aspirerat tillstånd och efter att aspirationen släppts (Fig. 4c). Vi resonerade att brott på pälsen på detta sätt störde clathrin-clathrin-bindningarna samtidigt som interaktioner mellan clathrin-membranen inte påverkades, vilket möjliggjorde för oss att uppskatta μ c − c oberoende av μ c − m . Från Δ Pc och Rp uppskattade vi μ c − c = 1, 1 ± 0, 1 × 10 −4 Nm −1 (se kompletterande anmärkning 1). Detta värde kan inte skiljas från μ 0 = 1, 0 ± 0, 5 × 10 −4 Nm −1, vilket bekräftar att clathrin – clathrin-interaktioner är de dominerande interaktioner som är ansvariga för clathrincoats montering som i byggnadsställningsmodellen. Att multiplicera μ c − c med det specifika området a ≃ 800 nm 2 ockuperat av en triskelion (se kompletterande anmärkning 2) ger den bindande energin per triskelion aμ c − c = 23 ± 3 k B T. Vårt värde på den bindande energin överensstämmer med en tidigare teoretisk uppskattning baserad på den kritiska koncentrationen av clathrinpolymerisation 25, aμ c − c = 42 k B T , och med uppskattningar som kommer från beräkningsmonteringsstatistik 26, där aμ c − c = 23 k B T. Dessutom är den för stor för att möjliggöra interna omarrangemang av clathringitteret när det har polymeriserats, vilket innebär att clathrinknoppar direkt polymeriseras till böjda strukturer snarare än att gå igenom en hexagonal platt beläggnings-mellanprodukt.

Image

( a ) Schematiska och konfokala bilder av AP180 / AF488-clathrin-belagda GUV: er före och efter aspirering med hjälp av en pipett. Pilar visar den clathrin-obesträckta delen av membran tungan. ( b ) tungans längd kontra aspirationstrycket (Δ P ). ( c ) AF488-clathrin före och efter aspiration (tungan helt frisatt). Pilspetsar visar på sprickor i clathrinbeläggningen. Skalstänger, 5 μm. Experimentet upprepades 12 gånger för att mäta det genomsnittliga aspirationstrycket Δ P för skador på skador.

Bild i full storlek

Espin underlättar klathrinpolymerisation

För att ytterligare validera vår modell använde vi dessa resultat för att förutsäga formen på clathrinrockar genom att ändra parametrar. Vi testade denna förutsägelse experimentellt genom att undersöka den förutsagda rollen för böjstyvheten för att hämma spirande. Uttrycket

Image

innebär att ett ökat K bör minska värdet på polymerisationsenergin μ . Vi använde GUV: er med högre böjstyvhet som erhölls genom att lägga till sfingolipider och kolesterol (60% hjärnsphingomyelin (BSM), 30% DOPS, 10% PIP 2, med 50% kolesterol) för att öka böjstyvheten till k = 51 ± 20 k B T . Detta minskade medelvärdet på μ med mer än en storleksordning ( μ styv = 3, 7 × 10 −6 Nm −1 ), vilket innebar en markant minskning av den maximala spänningen som tillåter klathrinmontering till 3, 5 × 10 −6 Nm −1 . I överensstämmelse med vår förväntning misslyckades clathrin att binda till en övervägande majoritet av liposomer (fig. 5a) under isotoniska förhållanden trots signifikant bindning av AP180 (fig. 5d). Vi testade vidare huruvida klathrinpolymerisation kunde återställas genom att ändra membranspänning, men observerade inte någon clathrinbindning varken under hypotoniska eller hypertoniska förhållanden (se fig. 5b, c), vilket ytterligare visade påverkan av membranböjningsstivhet på clathrinpolymerisation.

Image

( a ) AF488-clathrin / AP180 binder inte till GUV: er med hög böjstyvhet (se Metoder) under isotoniska förhållanden. ( b ) AF488-clathrin binder inte till GUV: er med hög böjstyvhet under hypo-, iso- och hypertoniska förhållanden. ( c ) Antal vesikler som visar AP180 / clathrin-bindning eller ingen bindning under olika externa buffertförhållanden. ( d ) En hög bindningsstivhet utesluter inte bindning av AP180. ( e ) AF488-clathrin-bindning och membrandeformation i närvaro av omärkt epsin observerades under olika osmotiska betingelser, med undantag av under de hypotoniska förhållandena där en fraktion av vesiklarna förblev obelagda. ( f ) Procentandel vesiklar utan någon, liten eller stor deformation efter AF488-clathrin / epsin-bindning. Skala bar, 5 μm. För alla fluorescensförsök, n = 30–45 under varje tillstånd från minst tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

För att ytterligare testa vår modell förutspådde vi att alla adaptrar med membrandeformerande egenskaper skulle hjälpa spirande. Vi studerade således polymerisationen av clathrin på GUV: er som medierats av epsin. Vi fann att epsin binder till liposomer under alla testade membranspänningar (kompletterande fig. 8) utan att orsaka observerbara deformationer, liksom AP180. När GUV: er inkuberades med det ommärkta epsinet och AF488-clathrin under hypotoniska förhållanden, uppvisade 70% av vesiklarna membrandeformationer (Fig. 5e, f). Betydande membrandeformation och tubulering observerades också under isotoniska förhållanden. På samma sätt deformerades GUV: er under hypertoniska förhållanden kraftigt (fig. 5d). Således underlättade epsins membrandeformeringsegenskaper clathrinpolymerisation i en sådan utsträckning att den kunde binda till GUV även under ogynnsamma membranspänningsförhållanden.

Diskussion

I denna studie visade vi att formen på klatrinbelägg styrs av membranspänning. Denna mekanism är baserad på att motverka klathrinpolymerisation genom membranspänning, vilket hindrar stängningen av de klathrinbelagda groparna: vid låg membranspänning kan djupa knoppar bildas, medan mellanliggande eller höga spänningar endast resulterar i partiell knoppning. Vi mätte clathrin-polymerisationsenergin och hittade värden som ligger inom intervallet för in vivo- membranspänningsvärden (10 −5 –10 −4 Nm −1 — se ref. 27, 28, 29). Således täcker in vivo- värden på membranspänning formövergången från en grund till en djup knoppad beläggning, vilket stödjer en fysiologisk kontroll av klatrinknoppning genom membranspänning. Det överensstämmer med det faktum att klathrinmedierad endocytos försenas i celler som har högre membranspänning och kräver aktin för att fullborda 30, 31 .

Vi föreställer oss att membranspänningen på strukturell nivå inte tillåter rätt bindningsvinkel mellan triskelias armar, vilket försämrar deras korrekta förening.

Vi fann också att ökad membranstivhet motsätter sig clathrin-spirning. Det överensstämmer med det faktum att klathrinmedierad endocytos är långsammare vid den epikala polen hos epitel, där membranet är styvare än vid baspolen 32 . Vi fann också att membrandeformeringsförmågan hos epsin gynnar klatrinmedierad spiral, även när membranets elastiska parametrar (nämligen spänning och styvhet) inte är gynnsamma. Detta indikerar att de olika aktörerna som kan generera membrankurvatur (kilinsättning, trängsel eller lokala krafter som utövas av cytoskeletten) kan agera synergistiskt för att deformera membranet: adapternas roll och aktin i klathrininducerad membrandeformation har studerats utförligt. Slutsatser om huruvida de krävs eller är tillräckliga för membrandeformation visade sig emellertid svåra att generalisera till alla biologiska system. Våra resultat stöder en modulerande roll för varje adapter och aktin beroende på svårigheten att deformera membranet 31 : i ett extremt fall där membranet är mycket styvt och spänningen är hög, krävs alla parter, medan de blir dispenserbara under mellanförhållanden.

Av energiska 25, kinetiska och biokemiska skäl 33 verkade det mer gynnsamt att överväga att clathrin polymeriserar direkt till sin slutliga böjda form. Att förklara de olika formerna av clathrinbeläggningar har emellertid länge varit en fråga om debatt: det föreslogs 12 och analyserades teoretiskt 26, 34 hur clathringitteret kunde omorganiseras för att ändra form när den en gång var polymeriserad. En annan möjlighet är att klatrinbeläggningen är tillräckligt mjuk när den en gång har polymeriserats för att deformeras elastiskt under ökande spänning. Mätning av den klathrinbelagda membranböjningsstivheten visade emellertid att den är ungefär 10 gånger mer än fria lipidmembran, vilket står för mindre än 5% förändring i storlek genom elastisk deformation (teorin visas inte). Dessutom gynnar vår modell och fynd den direkta polymerisationen av clathrin i ett krökt gitter med AP180. De redogör också för hur knoppens form kan moduleras av membranspänning. Våra fynd är förenliga med det faktum att partiell nedslagning av clathrin genererar grunt gropar in vivo 35, eftersom vår modell förutsäger en minskning av clathrins cytosoliska koncentration skulle resultera i en sänkning av dess polymerisationsenergi μ . Liknande grunt beläggningar observerades också med både H6-ANTH-AP180 och H6 -AP180 i full längd, tillsammans med clathrin i en ny rekonstitutionsstudie som antydde att klathrinpolymerisation enbart kunde driva membranböjning 13 . Polymerisationen av andra membranbeläggningar har också visat sig bero på spänning. Sådana exempel inkluderar formen på Coat Proteins I (COPI) -rockar som ändras från platt till ett knoppat tillstånd när spänningen minskas 36, och grottor som kan störas av ökad membranspänning 28 . Mer generellt spelar aktin en kritisk roll i bildningen av klathrinknopp, i alla celltyper som har studerats, från jäst 37 till däggdjur 28, 29 . Actin är den huvudsakliga membranspänningsregulatorn i eukaryota celler. Dess roll i klathrinmedierad endocytos kan således indikera att membranspänning är en allmän regulator för klathrinmedierad endocytos.

metoder

material

1, 2-dioleoyl- sn- glycero-3-fosfokolin (DOPC), 1, 2-dioleoyl- sn- glycero-3-fosfoetanolamin (DOPE), L-a-fosfatidylinositol (lever PI), DOPS, PIP 2, BSM di-stearoylfosfatidyletanolamin-PEG (2000) -biotin och kolesterol köptes från Avanti Polar Lipids. Fluorescerande lipid bodipy-tetra-metyl-rodamin-PIP 2 (TMR-PIP 2 ) köptes från Echelon Biosciences. Två lipidkompositioner användes— (1) 25% DOPC + 30% DOPE + 5% lever PI + 30% DOPS + 10% PIP 2 kompletterat med 15% kolesterol och 1% TMR-PIP 2 ; (2) 60% BSM + 30% DOPS + 10% PIP 2 + 1% TMR-PIP 2 kompletterat med 50% kolesterol. streptavidinbelagda polystyrenpärlor (3, 05 μm) som användes för dragningsexperiment av nanor köpdes från Spherotech. Clathrin extraherades från färska svinhjärnor och renades såsom beskrivs i ref. 15. Clathrin märktes med Alexa Fluor 488 C5 maleimid (Invitrogen). AP180 uttrycktes i BL21 / DH3a-celler och renades genom glutation S-transferas-neddragning och glutation-S-transferas klyvt med PreScission-proteas. AP180 märktes med Alexa Fluor 488 C5 maleimid (Invitrogen). Epsin renades från celler infekterade med baculovirus såsom beskrivs i ref. 5 och märkt med Alexa Fluor 488 C5 maleimid (Invitrogen). Alla proteiner delades ut i GTPas-buffert (HEPES 20 mM pH = 7, 4, NaCl 100 mM och MgCl2 1 mM) och lagrades vid -80 ° C.

Beredning av GUV: er

GUV: erna bestod av 25% DOPC, 30% DOPE, 5% lever PI, 30% DOPS, 10% PIP 2, 15% kolesterol och 1% TMR-PIP 2 (fluorescerande lipid) i kloroform / metanol i en koncentration av 2 mg ml −1 . Lipidblandningen torkades under N2-flöde och torkades ytterligare under vakuum under 1 timme innan den återsuspenderades i ren kloroform. För att erhålla ett bra utbyte av GUV: er innehållande mycket negativt laddade lipider utfördes elektroformationen av GUV: er som beskrivs i ref. 21. I korthet torkades först en enhetlig utstrykning av 10 ul lipidblandning vid 2 mg ml-1 på ledande indium-tennoxidbelagt glas (Präzisions Glas och Optik GmbH) under 30 minuter vid 60 ° C, följt av torkning under vakuum under minst 1 timme. Lipidfilmen rehydratiserades sedan i en sackaroslösning vid 208 ± 1 mOsm och GUV fick växa under 1 timme under sinusspänning (900 mV, 10 Hz). För iso-osmotiska experimentbetingelser användes en sackaroslösning med lika osmolaritet som proteinlösningen, medan för hypertoniska och hypotoniska betingelser användes mer koncentrerade eller mindre koncentrerade (respektive) sackaroslösningar.

Konfokal mikroskopi

En öppen hemmagjord observationskammare inkuberades med en 2 mg ml-1-kaseinlösning under 15 minuter för att undvika vidhäftning av GUV till täckglaset. Kammaren sköljdes sedan två gånger med GTPas-buffert (se ovan) innan man injicerade 180 ul av samma buffert innehållande proteinerna. Slutkoncentrationerna av AP180 och clathrin var 0, 5 respektive 0, 4 μM. Proteinblandningen fick jämviktas i kammaren följt av injektion av 4-5 μl GUV. Bildbehandling utfördes med ett Nikon-konfokalt mikroskop. Identiska lasereffekter och förstärkningsinställningar användes under alla experiment.

Elektronmikroskopi

Ett överskott av GUV: er i olika osmotiska miljöer inkuberades med proteinblandning och visualiserades genom konfokal fluorescensmikroskopi för bindning av AP180 / clathrin. De proteinbundna GUV: erna fixerades med 4% glutaraldehyd, inbäddade i 2% agar för att öka sedimenteringen av liposomerna och snurrades i 5 000 varv / min under 3-4 minuter för att pelletera ner provet. Provet behandlades med 0, 4 M Millonigs buffert (natriumfosfat (monobasisk) + NaOH) innehållande 2% osmiumtetroxid under 1 timme och sköljdes med ddH20. Provet färgades med 0, 25% uranylacetat över natt och sköljdes med ddH20 följt genom sekventiell dehydrering i 30, 50, 70 och 90% etanol under 5–10 minuter. Det sista dehydratiseringssteget genomfördes tre gånger i absolut etanol under 30 minuter vardera. Provet tvättades sedan med propenoxid två gånger under 10 minuter följt av inkubering i epon-propylenoxid (1: 1) under 1 timme. Slutligen behandlades provet med 100% epon över natt vid rumstemperatur innan det inbäddades i 1 ml eponhartsblandning följt av härdning vid 65 ° C under minst 24 timmar. Ultratinsektionering utfördes med användning av en mikrotom (Leica Ultracut) vid en skärvinkel av 6 °. Sektioner placerades på glöd-urladdade kolbelagda formvarnät och betraktades med ett Tecnai G2 Sphera (FEI) elektronmikroskop vid en accelerationsspänning på 160 kV och en exponeringstid på 1 000 ms. För EM-observationer med negativ fläck inkuberades först LUV: er först med AP180 / clathrin i suspension under 10–15 minuter och adsorberades sedan på Formvar-belagda EM-galler. Proverna fixerades och färgades negativt med 2% uranylacetat före visualisering.

Clathrin-polymerisationsenergimätningar

GUV: er aspirerades i en mikropipett styrd av en motoriserad mikromanipulator (Sutter MP225) och ett skräddarsytt hydraulsystem för att kontrollera sugningstrycket Δ P och för att ställa in membranspänningen:

Image

där Rp och R v är radierna för pipetten respektive GUV. En membran nanorör dras ut från en GUV vars membran var fäst vid en streptavidin-belagd pärla (3, 05 mikrometer diameter, Spherotec) hålls i en fast optisk fälla. Den optiska fällan var skräddarsydd med en ytterbiumfiberlaser fokuserad genom ett 100 x 1, 3 numeriskt mål för oljedyp. Kraften F som utövas på pärlan beräknades från Hookes lag: F = k * Δ x , där k är fällans styvhet ( k = 360 pN μm −1 W −1 ) kalibrerad med den viskösa dragmetoden 38 och Δ x förskjutningen av pärlan från dess jämviktsposition i den optiska fällan uppmätt med en skräddarsydd videospårningsprogramvara. AP180 och clathrin injicerades nära nanoröret med användning av en andra mikropipett med en typisk radie på 10 um kontrollerad med en hydraulisk mikromanipulator (Narishige). Nanorören visualiserades samtidigt genom ljusfältavbildning (Pixelink-kamera) och med dubbelfärgad konfokalmikroskopi ( X 1 = 488 nm och X 2 = 543 nm) på ett inverterat Nikon eclipse Ti-mikroskop. Clathrin-polymerisationsenergin mättes för ökande värden på inställda membranspänningar.

Bildanalys

Bilder analyserades och bearbetades med ImageJ. The fluorescence signal, F vesicle along the equatorial plane of GUVs was quantified by measuring the average fluorescence of the membrane using the OvalProfile plugin of ImageJ. The background fluorescence of the unbound protein, F background was measured in an area close to the vesicle. Fluorescence intensity of the vesicle was denoted as I= ( F vesicle −F background ). Same illumination and detection settings were used for all the experimental conditions. Electron micrographs were manually analysed using ImageJ to measure the average bud diameter of 65±5 nm under hypertonic conditions.

Atomic force microscopy on supported bilayer

Ten μl of a 10-mg ml −1 lipid mixture was dropped onto a circular glass coverslip, air dried and kept under vacuum for at least 1 h. The dried lipid smear was hydrated with 90 μl of GTPase buffer for 30 min, followed by rinsing to peel off the membrane regions that did not adhere to the surface. Two μl of the protein mix (AP180+clathrin) was incubated with the adhered membrane sheet for 30 min, followed by rinsing with GTPase buffer to wash the unbound protein. The protein-binding membrane sheet was then fixed with 4% glutaraldehyde and 1.8% osmium tetroxide for 1 h, followed by washes with GTPase buffer. The sample was then dehydrated by series of ethanol washes (30%, 50%, 70% and 90% ethanol for 5 min each) and further kept overnight under absolute ethanol. The dried sample was then imaged using the Multimode V AFM (Veeco) in tapping mode. Pointprobe Plus tips (Nanosensors, Neuchatel, Switzerland) with non-contact high frequency ( C =42 Nm −1, f o =330 kHz) were used for scanning the image.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Figures 1-8, Supplementary Table 1, Supplementary Notes 1-2 and Supplementary Discussion

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.