Ba-j som en ny cdk1-hämmare inducerar selektivt apoptos i cancerceller genom att reglera ros | vetenskapliga rapporter

Ba-j som en ny cdk1-hämmare inducerar selektivt apoptos i cancerceller genom att reglera ros | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Läkemedelsutveckling
  • Läkemedelsupptäckt och utveckling
  • Naturprodukter

Abstrakt

Cyklinberoende kinas 1 (CDK1) är det enda nödvändiga CDK vid cellproliferation och ett nytt mål för utvecklingen av läkemedel mot cancer. 8-Hydroxypiperidinmetyl-baicalein (BA-j) är en ny selektiv CDK1-hämmare med brett spektrum anti-canceraktivitet (IC 50 12, 3 μM) och 2 tumörxenografts. På grund av de differentiella mekanismerna som kontrollerar redox-tillstånd i normala celler och cancerceller, kan BA-j fånga syrefria radikaler ( · O 2 - ) och selektivt höja nivån av H2O 2 i cancerceller, och därmed specifikt oxidera och aktivera det inneboende apoptosvägen genom att kringgå den extrinsiska dödesreceptorvägen och därmed inducera apoptos i cancerceller snarare än i normala celler. BA-j skiljer sig från cytotoxiska anticancerläkemedel som kan aktivera både den inre apoptosvägen och den extrinsiska dödsreceptorvägen, och därför skadar normala celler under avlivning av cancerceller. De molekylära och biokemiska mekanismerna för ROS-reglering föreslår att BA-j kan utvecklas till ett nytt medel mot cancer.

Introduktion

Upptäckten av nya läkemedel mot cancer som selektivt kan inducera apoptos i cancerceller är en utmanande och viktig uppgift inom läkemedelsvetenskap. Cyklinberoende proteinkinaser (CDK) är viktiga signalmolekyler vid regleringen av cellcykeln. CDK: er är specifika serin / treoninproteinkinaser i cytoplasma och kärna som fungerar som mediatorer i signaltransduktionsvägar. CDK1 är den enda nödvändiga CDK i cellproliferation och ett nytt mål för utvecklingen av läkemedel mot cancer 1, 2, 3. Nyligen har den globala läkemedelsforskningen mot läkemedelscancer vänt sin uppmärksamhet mot CDK-hämmare, varav 20 har deltagit i kliniska studier 1, 4, 5 Selektiviteten hos de flesta CDK-hämmare som för närvarande är i kliniska studier är otillfredsställande. Vissa visade hämmande aktivitet på CDK2 (dvs. verkar i S-fas och ökar toxiciteten) och vissa biverkningar på grund av deras komplexa kemiska strukturer. CDK-hämmare baserade på organiska aminderivat av flavonoid, såsom Flavopiridol 6, 7 och P276-00 8, 9, 10, har väckt mest intresse. På grund av deras dåliga löslighet och biotillgänglighet, låga blodkoncentration, svårigheter i katabolism och snabb utsöndring genom glukuronidering är dessa molekylers droppbarhet otillfredsställande.

Den mest artificiellt odlade medicinska arten i Kina är Scutellaria baicalensis , en flerårig ört vars torkade rot ofta används i traditionell kinesisk medicin för behandling av hyperlipomia, hypertoni, hyperglykemi, inflammation, allergiska reaktioner, virusinfektioner, cancer och så vidare. De viktigaste aktiva ingredienserna i Scutellaria baicalensis är flavonoider och mer än 40 flavonoidstrukturer har identifierats i denna anläggning 12, 13 . Den vanligaste flavonoiden i Scutellaria baicalensis är Baicalin (9–21%), och dess hydrolysat, Baicalein (BA), har starkare styrka. Naturliga flavonoider är selektiva CDK1-hämmare, och BA är den mest potenta bland dem med den anti-proliferativa aktiviteten IC 50 25–75 μM 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 . På grund av de differentiella mekanismerna som kontrollerar redox-tillstånd i normala celler och cancerceller, genom att reglera reaktiva syrearter (ROS) av BA 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, kan ROS specifikt oxidera vissa enzymer med aktivt ställe av cystein. Såsom BA kan hämma CDK1 genom att oxidera CDC25C och därmed undertrycka proliferation i cancerceller 15, 19, 25, 32 . Vidare kan BA aktivera de inneboende apoptotiska vägarna genom att oxidera kaspaser 15, 16, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 33 genom att kringgå den extrinsiska dödreceptorvägen 16, 24, 31, sålunda inducerar apoptos i cancerceller och aktiverade lymfocyter snarare än i normala celler 17, 21, 23, 30, 31, 33, 34, 35 . Emellertid förstås den exakta biokemiska mekanismen för BA genom reglering av ROS endast delvis och det är också sättet BA som reglerar ROS.

Oral Baicalin kan inte absorberas direkt förrän det har hydrolyserats till BA genom tarmmikroflora, men "enterohepatiska effluxeffekter" inaktiverar och utsöndrar 95% av BA via glukuronidering och sulfation. Därför är nivån av BA i blod mycket låg (Cmax 0, 26 μM) med dålig biotillgänglighet genom oral BA 36, 37, 38, 39, 40, 41 . Dessutom oxideras BA lätt och praktiskt taget olösligt i vatten, vilket gör det svårt att administrera intravenöst. På grund av dess dåliga biotillgänglighet och oönskade egenskaper som läkemedel uppfyller BA inte kraven för klinisk behandling av cancer 24 .

Därför har försök gjorts att öka effektiviteten hos BA genom strukturella modifieringar. De mest effektiva strukturella modifieringarna är troligtvis BA Mannich- basderivat 42, 43, 44 . I vårt tidigare arbete användes dussintals naturliga flavonoider som blyföreningar för att skapa hundratals Mannich-basderivat av flavonoider. Med användning av CDK1 / Cyclin B-hämmande aktivitetsscreening och struktur-aktivitetsrelationsstudier identifierades 8-hydroxypiperidin-metyl-baicalein (BA-j) som det mest effektiva flavonoid Mannich-basderivatet 45 . BA-j är en selektiv CDK1-hämmare med en ny kemisk struktur 45 .

I detta dokument studerades den molekylära och biologiska mekanismen för BA-j som specifikt inducerar apoptos i cancerceller och hur BA-j-reglering av ROS undersöktes med användning av en fluorescerande PF1-sond för att selektivt bestämma nivån av intracellulär H202. Dessa data ger bevis på att BA-j kan utvecklas till ett nytt cancerläkemedel för klinisk användning.

Resultat

Beredning och karakterisering av BA-j

Den viktigaste aktiva ingrediensen i roten av Scutellaria baicalensis Georgi är Baicalin. Baicalein (BA, Sigma, 98% rent) hydrolyserat från Baicalin användes som en blyförening och reagerade med 4-hydroxipiperidin och formaldehyd i metanol genom Mannich-reaktion för att erhålla BA-j, med> 90% utbyte, 99, 0% renhet och <2, 0% totalt relaterade ämnen (Fig. 1a) 45 .

( a ) Beredning av BA-j. ( b ) Inhiberande aktivitet mot CDK1 av 8-hydroxypiperidinmetyl-baicalein (BA-j). ( c ) Hep G2-celler behandlades med 10 um BA-j under 24 timmar, och analysen av proteinnivå i HepG2-cellsignaleringsvägar bestämdes med Western blot för konjugerad sekundär antikropp (get-antimouse IgG / FITC) med användning av densitometrisk avsökning och normaliseras med användning av interna standarder (ß-aktin). ( d ) Hep G2-celler behandlades med 10 och 20 um BA-j under 24 timmar, och uttryck av CDK: er och CDC25C-proteiner i HepG2-cellsignaleringsvägar bestämdes med Western blot för den lämpliga sekundära antikroppen (pepparrotsperoxidas-konjugerad get- antimouse IgG).

Bild i full storlek

BA-j är ett gult, fast, kristallint pulver, innehållande 99, 1% 5, 6, 7-trihydroxi-8- (4-hydroxi-piperidin-1-ylmetyl) -2-fenyl-kromen. Torkades under reducerat tryck vid 80 ° C under 4 timmar, en enda smältande endotermisk topp visades vid 215 ° C av DSC. UV (metanol): Xmax 277 nm, 322 nm. HRMS (TOF ES + ) m / z: 384.1441 [M + H] + (teoretiskt värde 384.1447), molekylvikt (C21H21NO6): 383.14. IR (KBr, cm-1): 3059 (v ArC-H ), 2961, 2822, 1679 (vC = O ), 1574 (v ArC = C ), 1549, 770, 696. BA-j CH3S03 H, 13C-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 5: 182, 24 (C-4), 163, 25 (C-2), 153, 62 (C-9), 149, 31 (C-7), 148, 34 (C-5) 132, 07 (C-1 '), 130, 81 (C-4'), 129, 27 (C-3 ', 5'), 128, 83 (C-6), 126, 69 (C-2 ', 6'), 104, 91 (C-6) -8), 104, 08 (C-10), 95, 90 (C-3), 50, 72 (C-4 '), 47, 60 (C-2', 6 '), 39, 50 (C-1', CH3SO3H) 29, 35 (C-3 ', 5'). ' H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 5: 8, 17-8, 15 (m, 2H, Ar-2', 6'-H), 7, 65-7, 59 (m, 3H, Ar-3 ', 4', 5 ′-H), 7, 09 (s, IH, 3-H), 4, 98 (s, IH, 4'-OH), 4, 51 (s, 2H, C8-CH2), 3, 67 (m, IH, 4 '- CH), 3, 41-3, 40 (m, 4H, 2 ', 6' -CH2), 2, 30 (s, 3H, CH3S03H), 1, 85-1, 59 (m, 4H, 3 ', 5' -CH2) ). Den karakteristiska toppen för BA C8-H vid 6, 60 försvinner och ersätts av en BA-j C8-CH2-ersättande karakteristisk topp vid 6, 17. BA-j är 5, 6, 7-trihydroxi-8- (4-hydroxipiperidin-l-ylmetyl) -2-fenyl-kromen.

PKa för BA-j är 5, 56, logP 0, 68 (oktanol / vatten), och dess löslighet är 58 mikrometer i vatten och 376 mikrometer i PBS. BA-j är stabil i PBS under mörka förhållanden. BA-j kan dock fånga vid rumstemperatur under ljus. · O 2 - släpp H202 och oxideras och hydrolyseras till 8-hydroximetyl-5, 6-dehydrogenering-baicalein.

Mål för BA-j-screening

Med användning av naturliga flavonoider som blyföreningar semi-syntetiserades hundratals flavonoid Mannich-basderivat. Dessa derivat screenades för sin hämmande aktivitet mot CDK1 / Cyclin B av FRET, och deras struktur-aktivitetsförhållande analyserades 44, 45 . Den hämmande aktiviteten för BA-j var den starkaste (CC 50 0, 30 ± 0, 11 μM), liknande Flavopiridol (CC 50 0, 33 ± 0, 14 μM), och ungefär 20 gånger starkare än blyföreningen BA (CC 50 6, 53 ± 0, 21 μM) och cirka 50 gånger starkare än Baicalin (CC 50 14, 36 ± 0, 23 μM) (Fig. 1b). Dessa resultat antyder att BA-j som en substratförening för ATP direkt kan hämma aktiviteten hos CDK1 / cyklin B.

För att bekräfta målet för BA-j behandlades Hep G2-celler med 10 och 20 mikrometer BA-j under 24 timmar, varefter proteinnivåerna för signalvägar i HepG2-celler bestämdes med Western blot för konjugerad sekundär antikropp (get-antimouse IgG / FITC) med användning av densitometrisk skanning och normaliserat med användning av interna standarder (p-aktin), såsom visas i fig. 1c. Bland dem bestämdes uttryck av CDK: er och CDC25C-proteiner i HepG2-celler med Western blot för den lämpliga sekundära antikroppen (pepparrotsperoxidas-konjugerad get-antimouse IgG), såsom visas i fig. 1d. Dessa resultat visade att 10 mikrometer BA-j kan hämma uttrycket av CDC25C, CDK1 (p-cdc2-Tyr15-Thr14), CDK1 (p-cdc2-Tyr15) och Cyclin B1, snarare än CDK2, CDK4, CDK6, Cyclin D och Cyclin E.

Eftersom BA-j kan fånga · O2 - och selektivt öka nivån av H202 i Hep G2-celler hämmas aktiveringen av CDK1 av H202-oxiderande CDC25C. Dessa resultat antyder att BA-j kan hämma CDK1 / cyklin Bl genom att oxidera CDC25C, snarare än andra CDK: er.

Kreft mot cancer

Anti-proliferativa effekter av BA-j in vitro på cancerceller

Anti-proliferationsaktiviteten för BA Mannich-basderivat screenades och BA-j var den mest potenta. BA-j hade antiproliferativa effekter på 12 humana cancercellinjer in vitro och dess IC50 var 12, 3 μM (4, 7 μg / ml, bestämd via MTT-analys), ungefär fyra gånger kraftigare än BA (IC 50 ungefär 50 μM) 11, såsom visas i tabell 1. Den genomsnittliga hastigheten för proliferationshämning i 60 typer av humana cancerceller behandlade med 10 mikrometer BA-j var 40, 6% (US National Cancer and AIDS Research Center, av SRB). SFDA: s "riktlinjer för antitumörläkemedelsforskning" föreskriver att när IC50-värdena av föreningar eller naturliga läkemedel som hämmar proliferation av cancerceller är mindre än 10 μg / ml respektive 20 μg / ml, anses de ha anticanceraktivitet in vitro . När tumörinhiberingshastigheten är högre än 40% anses läkemedlet ha antitumoraktivitet in vivo . Våra resultat indikerar att BA-j har betydande, brett spektrum anti-spridningsaktivitet i cancer, utan selektivitet för en specifik typ av cancer. Till skillnad från cytotoxiska läkemedel mot cancer kan BA-j till och med minska tillväxten av läkemedelsresistenta cancerceller.

Full storlek bord

BA-j hämmar selektivt proliferation i cancerceller snarare än normala celler

För att undersöka effekterna av BA-j på normala celler odlades normala humana primära hepatocytceller (lever) och normala humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) i närvaro av BA-j under 48 timmar. Den anti-proliferativa aktiviteten för BA-j i normala celler jämfördes med den i Hep G2 och HL-60 cancerceller, som visas i fig. 2a – c. Dessa resultat visade att BA-j uteslutande inhiberade proliferation i Hep G2- och HL-60-celler snarare än normala leverceller eller PBMC. Dessa resultat indikerar att BA-j har anti-proliferativ aktivitet i cancerceller snarare än i normala celler, medan det cytotoxiska läkemedlet HCPT var aktivt i både cancerceller och normala celler.

Celler odlades i närvaro av BA-j under 48 timmar och en MTT-analys användes för att bestämma anti-proliferationsaktiviteten. ( a ) Anti-spridningsaktivitet av BA-j i 12 humana cancercellinjer jämfört med BA- och HCPT-behandling. ( b ) BA-j-anti-proliferationsaktivitetsjämförelse mellan Hep G2-celler och normala leverceller. ( c ) BA-j-anti-proliferationsaktivitetsjämförelse mellan MCF-7-celler och normala PBMC. ( d, e ) Tumörxenograftmodeller av SGC-7901 och H-460-celler i manliga BALB / c-nakna möss behandlade med po 10 mg / kg BA-j två gånger dagligen under 10 dagar.

Bild i full storlek

Vid användning av BA-j med Acetyi-cystein (som H202-rensare) som kombinerad behandling till Hep G2 och HL-60 hämmas dessutom anti-spridningsaktiviteten för BA-j bestämd av MTT och nivån av H2O2 reducerad mätt med PF1. Eftersom BA-j kan fånga · O2 - och släppa H202 med oxiderande Acetyl-cystein till cystin, hämmas BA-j-inducerande apoptos av Acetyl-cystein. Dessa resultat visade att Acetyl-cystein kan lindra anti-spridningsförmågan hos BA-j i cancerceller genom att minska H202 46 . (Se tabell 2) Således föreslås att CDC25C kan oxideras av H202 som frisätts genom BA-j-fångst · O2 -, vilket resulterar i antiproliferation så småningom.

Full storlek bord

Anti-tumöreffektivitet in vivo av BA-j

Antitumoreffekten av BA-j i xenograftmodeller av humant gastriskt karcinom (SGC-7901) och icke-småcelliga lungkarcinom (H-460) i BALB / c nakna möss utvärderades ytterligare. Oral administration av 10 mg / kg BA-j två gånger dagligen under 10 dagar resulterade i en signifikant minskning av tumörtillväxt hos möss som bär SGC-7901 och H-460 xenografts och en genomsnittlig viktminskning på 10–15% jämfört med kontrollgruppen. Efter 10 dagars BA-j-behandling minskades tumörvolymen med> 50% av den ursprungliga tumörstorleken hos möss som bär SGC-7901 och H-460 xenografts (P <0, 05). Dessa resultat indikerar att administrering av BA-j kan minska volymen av tumörer SGC-7901 och H-460. Tillväxtinhiberingen hos möss som bär SGC-7901 och H-460 tumörer på den 30: e dagen efter randomiseringen var 76, 7 ± 8, 2% respektive 82, 1 ± 10, 3% jämfört med kontrollgruppen (n = 9, P <0, 01), såsom visas i fig. 2d, e. Dessa resultat indikerar att BA-j (10 mg / kg) kan minska tillväxten av SGC-7901 och H-460 xenografts in vivo med> 75%.

LD 50 för injektionstillförsel av BA-j i möss är 1 g / kg. För att undersöka effekterna av BA-j på normala möss genomfördes oral administration av 10 mg / kg BA-j två gånger dagligen under 10 dagar, och det visade nästan ingen toxicitet eller onormalitet i vävnadssektioner. Dessa resultat indikerade att BA-j inte hade några effekter på normala möss.

Molekylär mekanism för att inducera apoptos i cancerceller

Morfologisk observation av induktion av apoptos i MCF-7-celler

Hoechst 33258 är en aktiv fluorokrom som specifikt binder DNA, främst vid AT-rika områden, som avger en blå fluorescens under UV-excitation. Kärnorna i levande celler avger en enhetlig fluorescens, medan apoptotiska celler avger en ljusblå fluorescens på grund av kromatinkondensation och tät färgning av de kompakta kärnorna. Efter att ha behandlats med BA-j under 48 timmar färgades MCF-7-celler av Hoechst 33258. Effekter på cellcellsmorfologin hos dessa celler visas i fig 3a. Ökande nivå av BA-j resulterade i en kraftig minskning av antalet levande celler, liksom tät fluorescensemission från kärnor och uppkomsten av apoptotiska kroppar runt karyotheca-marginalen, på ett anmärkningsvärt dosberoende sätt. Dessa resultat indikerar att BA-j signifikant kan inducera apoptos i MCF-7 bröstcancerceller.

( a ) Fluorescerande bilder av Hoechst 33258 färgade MCF-7-celler som visade induktionen av apoptos efter en 48 timmars BA-j-behandling (200 x). ( b ) Effekter av BA-j-behandling (48 timmar) på cellcykeln i MCF-7 och HL-60-celler bestämdes med användning av PI-färgning. ( c ) Behandling av MCF-7 och HL-60 under 48 timmar med BA-j inducerar apoptos. Cellapoptos demonstrerades med användning av Annexin V-FITC och PI-metoden. ( d ) Inhibering av Bcl-2-expression efter en 48 timmars BA-j-behandling i MCF-7 och HL-60-celler. ( e - g ) MMP minskas och caspaser aktiveras i MCF-7 och HL-60-celler behandlade med BA-j under 48 timmar. ( e ) BA-j-behandling minskade MMP i MCF-7 och HL-60-celler. ( f ) BA-j-behandlingsaktiverad caspase-8 och caspase-3 i MCF-7-celler. ( g ) BA-j-behandlingsaktiverad caspase-8 och caspase-3 i HL-60-celler.

Bild i full storlek

Effekter på cellcykeln

PI kan specifikt binda till DNA med ett bra linjärt samband mellan fluorescensintensiteten och bindningen. Efter fixering och färgning med PI kan DNA-innehållet i celler analyseras kvantitativt med användning av flödescytometri. Eftersom olika cellcykelfaser har olika nivåer av DNA-innehåll kan följaktligen effekterna av ett läkemedel på progression genom cellfaserna bestämmas. Det finns många distinkta förändringar på cell- och molekylnivå som inträffar under apoptos, bland de mest karakteristiska är förändringar i kärnan. Aktiverat endonukleas resulterar i DNA-nedbrytning, en minskning i antalet apoptotiska celler och uppkomsten av en hypodiploid apoptos-topp (sub-G1) före G0 / G1-toppen. Resultaten av PI-fluorescensfärgning av MCF-7 och HL-60-celler behandlade med BA-j under 48 timmar visas i fig. 3b. BA-j-behandling ledde till dosberoende arresteringar i G1- och G2-fasen i MCF-7 och HL-60-celler, och en dosberoende tillväxt i andelen av den apoptotiska toppen (sub-G1). Dessutom resulterade en hög nivå av läkemedlet i en minskning av antalet celler i S-fas. Det fanns inget DNA <185 Da i sub-G1. Dessa resultat indikerar att BA-j kan inducera G1- och G2 / M-arrestering, minska antalet celler i S-fas och inducera apoptos, snarare än inflammation och nekros, i MCF-7 och HL-60-celler.

Apoptosinduktionsanalys

En serie morfologiska förändringar inträffar under apoptos; förändringar i plasmamembranet är karakteristiska för tidig apoptos. När celler börjar genomgå apoptos, vänder cellmembranet fosfolipidftaleinserin (PS) från insidan till utsidan av membranet och blir exponerat på cellytan. Annexin V är ett Ca 2 + -beroende fosfolipidbindande protein, som har en hög affinitet till PS och specifikt kan binda till PS exponerad på utsidan av plasmamembranet. Men PS överförs till utsidan av membranet, inte bara under apoptos utan också under cellnekros. De två dödsmekanismerna kan särskiljas genom att membranet är intakt under de initiala faserna av apoptos, men trasiga i celler som genomgår nekros. PI är ett färgämne för nukleinsyra som kan genomsyra membranet och färga kärninnehållet i avancerade stadier av apoptos och nekros, men kan inte tränga igenom det intakta membranet hos levande och tidigt apoptotiska celler. Med användning av Annexin V-FITC tillsammans med PI kan således förhållandet mellan apoptotiska och nekrotiska celler bestämmas med flödescytometri. Resultaten av co-färgning med Annexin V-FITC och PI fluorescerande färgämnen i MCF-7 och HL-60 celler behandlade med BA-j under 48 timmar visas i fig 3c. BA-j-dosberoende inducerad apoptos i MCF-7 och HL-60-celler. När MCF-7 och HL-60-celler behandlades med 40 μM BA-j under 48 timmar förändrades inte procenten av tidiga nekrotiska celler, medan procentandelen av tidiga apoptotiska celler ökade till 34, 2% respektive 29, 6%, och av sena apoptotiska celler till 16, 9% och 9, 8%; därför ökade de totala apoptotiska cellerna till 51, 1% och 39, 4%. Dessa data visar att mängden tidiga apoptotiska celler ökade anmärkningsvärt med högre läkemedelsnivå, medan ökningen av sena apoptotiska celler på denna nivå var mer blygsam. Däremot inducerade det cytotoxiska anticancerläkemedlet HCPT apoptos på en låg nivå, men inflammation och nekros på en hög nivå. Dessa resultat antyder att till skillnad från cytotoxiska anticancerläkemedel, är den anti-proliferativa aktiviteten av BA-j i MCF-7 och HL-60-celler förknippad med att uteslutande inducera apoptos snarare än att direkt döda celler eller orsaka cellinflammation och nekros.

BA-j minskar uttrycket av Bcl-2

Det endoplasmiska retikulumet spelar en viktig roll i cellapoptos; det anti-apoptotiska proteinet Bcl-2 och det pro-apoptotiska proteinet Bax ligger på det. Balansen i Bcl-2 / Bax reglerar främjandet och hämningen av cellapoptos. Inhibering av uttrycket av Bcl-2 kan resultera i aktivering av kaspaser, vilket kan leda till en kaskadereaktion, vilket slutligen resulterar i cellapoptos. Uttrycksnivåerna för Bcl-2 i MCF-7 och HL-60-celler behandlade med BA-j under 48 timmar visas i fig. 3d. Uttrycket av Bcl-2 visade en dosberoende minskning efter BA-j-behandling, medan det inte fanns någon skillnad i Bax-uttryck. Dessa resultat antyder att BA-j hämmar uttrycket av Bcl-2, och denna hämning är associerad med aktivering av den intracellulära endoplasmiska retikulum apoptosvägen.

BA-j minskar mitokondriell membranpotential

Mitokondrier spelar en nyckelroll i celloptoptos. Den asymmetriska fördelningen av protoner och andra joner på vardera sidan av mitokondriell membran skapar mitokondriell membranpotential (MMP). Minskning av MMP är resultat i öppningen av mitokondria permeabilitetsövergångsporer och frisättning av pro-apoptotiska aktiva substanser, såsom cytokrom C, från mitokondriell matris till cytoplasma. Detta resulterar i aktiveringen av caspase-9, som är starten på den mitokondriella apoptosvägen, och orsakar en kaskadreaktion som leder till ytterligare aktivering av caspase-3, vilket slutligen resulterar i cellapoptos. Rhodamine 123 är en MMP-indikator som kan komma in i mitokondrialmatrisen för levande celler beroende på den nuvarande MMP. När Rhodamine 123 befinner sig i den mitokondriella matrisen minskas dess fluorescens. Under apoptos undergrävs membranets integritet och mitokondria permeabilitetsövergångsporer öppnas, vilket orsakar en kollaps av MMP och frigörandet av Rhodamine 123 från mitokondrier. Detta resulterar i en stark, gulgrön fluorescens, vars intensitet kan användas för att bestämma förändringar i MMP. MCF-7 och HL-60-celler behandlades med BA-j under 48 timmar och deras Rhodamine123-fluorescensfärgningsresultat visas i fig. 3e. MMP minskades med BA-j-behandling på ett dosberoende sätt. Dessa resultat antyder att BA-j minskar MMP, och denna minskning är associerad med aktivering av den intracellulära mitokondrierapoptosvägen.

Aktivering av caspase-3 och caspase-8

Caspaser (cystein-aspartiskt specifika proteaser) är en familj av aspartiska proteaser innehållande cystein, som har liknande strukturer och existerar i cytoplasma. Caspases är nära kopplade till apoptos och är också involverade i regleringen av celltillväxt och differentiering. Caspases är viktiga enzymer i processen med apoptos. Caspases är involverade i nästan alla signaltransduktionsvägar som förmedlar apoptos. Caspases 8, 9 och 12 är initiatorer av cellapoptos i ett tidigt stadium och caspases 3, 6 och 7 är exekutörer i sen fas. Det aktiva stället för kaspaserna är en sulfydryl av cystein, som finns i det inaktiva pro-kaspasstillståndet och är känsligt för H202. När ett pro-caspas oxideras av H2O2 till en -SS-dimer, förvandlas det till ett aktivt caspase-SS-caspase, vilket således inducerar apoptos. Om sulfydrylen från pro-caspase-9 är fri kommer den att kombineras med fosforylerat survivin, vilket hämmar apoptos och främjar celldelningen. Omvänt, om sulfydrylen från pro-caspase-9 oxideras av H202, kommer den att separeras från det fosforylerade survivinet, vilket hämmar celldelningen och främjar apoptos. MCF-7 och HL-60-celler behandlades med BA-j under 48 timmar, och aktiviteterna för caspase-3 och caspase-8 bestämdes, såsom visas i fig. 3f, g. Aktiviteten hos caspase-3 och caspase-8 ökade på ett dosberoende sätt. Dessa resultat indikerar att induktionen av apoptos genom BA-j i MCF-7 och HL-60-celler är förknippad med aktiveringen av caspase-8 och caspase-3, via direkt H202-oxidation, snarare än dödreceptormedling.

BA-j inaktiverar Fas / FasL

Dödsreceptorer är transmembrane proteiner som har många extracellulära cysteinrester och har intracellulär proteolytisk aktivitet som vidare överför dödsignalen. Dödsreceptorer tillhör tumörnekrosfaktorreceptorfamiljen som inkluderar Fas / FasL, TNFR-1 / TNFR-α och TRAILR / TRAIL. Tumörnekrosfaktorreceptorer kan inte oxideras och aktiveras av · O2 - eller H202, utan kan oxideras och aktiveras av NaOCl, som har en starkare oxidationseffekt. Cytotoxiska medel kan stimulera mitokondrier att frisätta NaOCl och aktivera dödsfaktorreceptorer, vilket kan orsaka cellinflammation och nekros.

Hep G2-celler behandlades med BA-j under 48 timmar, och uttrycket av Fas / FasL bestämdes. Såsom visas i fig. 4 fanns det ingen dosberoende effekt av BA-j på Fas-nivåer, medan 2 mikrometer HCPT, ett cytotoxiskt läkemedel mot cancer som användes som en positiv kontroll, visade en uppenbar induktion av Fas / FasL-uttryck.

2 um HCPT användes.

Bild i full storlek

Dessa resultat antyder att cellinflammation och nekros orsakad av cytotoxiska läkemedel mot cancer är nära förknippade med extrinsiska dödsreceptorer, vilket resulterar i skada på både cancerceller och normala celler. Dessa data antyder också att BA-js förbikoppling av den extrinsiska dödesreceptorvägen är associerad med dess resistens mot NaOCl-oxidation, vilket gör att BA-j kan skydda normala celler från inflammation och nekros.

Biokemisk mekanism för att inducera apoptos i cancerceller genom att reglera ROS

Resistens mot NaOCl-oxidation är avgörande för att skydda celler från inflammation och nekros

BA-j (EO = 0, 80 ev) kan oxideras till 8-hydroximetyl-5, 6-dehydrogenering-baicalein genom att fånga · O2 - och släppa H202 (bestämt genom PF1-oxidation till fluorescein), men BA-j kan inte oxideras av H202. BA-j kan också oxideras till 8-hydroximetyl-5, 6-dehydrogenering-baicalein av NaOCl utan att frigöra H202 (så oxideras PF1 inte till fluorescein), hydrerar NaOCl till NaCl och H20. · O2 - har en kort överlevnad, och den kan inte direkt oxidera en sulfhydryl av cystein. H202 (EO = 0, 68 ev) kan oxidera en sulfhydryl av cystein till en disulfidbindning snarare än en svavel-syre-grupp. NaOCl (EO = 1, 49 ev) kan oxidera en sulfhydryl av cystein till både disulfidbindningar och svavel-syre-grupper. Dessa resultat antyder att resistensen av BA-j mot NaOCl-oxidation är förknippad med att skydda celler från inflammation och nekros.

Höjd intracellulär H202-nivå är nödvändig för att selektivt inducera apoptos i cancerceller

Vi etablerade en metod för att mäta den intracellulära H202-nivån med användning av PF1-selektiva lysrörssonder. För att undersöka mekanismen för den selektiva induktionen av apoptos i cancerceller och reglering av intracellulär reaktiv syrgasart (ROS) av BA-j, bereddes en lika stor mängd primära humana hepatocyter (lever) och humana perifera mononukleära blodceller (PBMC). och behandlades med BA-j under 48 timmar och jämfördes med Hep G2 och MCF-7 cancerceller i intracellulära H202-test (PF1-metod). Fig. 5a visar fluorescensen i Hep G2- och MCF-7-cancerceller behandlade med 12, 5 μM BA-j under 4 timmar. Att behandla celler med en lägre nivå av BA-j resulterade i en svagare fluorescerande emission, medan högre nivåer av BA-j gjorde att de flesta celler blev apoptotiska och ökade antalet fluorescerande kroppar.

( a ) Fluorescerande avbildning av intracellulär H202 (upptäckt av PF1) i Hep G2 och MCF-7 cancerceller jämfört med normala leverceller och PBMC. Alla celler behandlades med 12, 5 mikrometer BA-j under 4 timmar. (Överst: ljust fält, botten: excitationsvåglängd 488 nm, emission våglängd 525 nm, 64 ×) ( b ) Analys av intracellulär H202 efter läkemedelsbehandling i Hep G2 och MCF-7 cancerceller jämfört med normala leverceller och PBMC. Cellerna odlades i närvaro av läkemedel under 4 timmar och nivån av intracellulär H202 detekterades med PF1.

Bild i full storlek

Hep G2, lever, MCF-7 och PBMC inkuberades med BA-j, BA eller HCPT under 4 timmar och nivån av H202 detekterades med användning av PF1-fluorescenssonder, såsom visas i fig. 5b. När Hep G2 och MCF-7 cancerceller inkuberades med BA-j, uppvisade H202-nivåer en anmärkningsvärd dosberoende ökning, medan leverceller och PBMC inte gjorde det. BA-j kan selektivt öka H2O2-nivån i Hep G2- och MCF-7-cancerceller snarare än i normala leverceller och PBMC genom att fånga · O 2 - och släppa H202. BA-j är också associerad med att selektivt inducera apoptos i cancerceller men inte i normala celler. Däremot indikerade resultaten att det cytotoxiska läkemedlet HCPT inte hade någon selektivitet för att öka H202-nivåer; det skulle skada normala celler och döda cancerceller. BA-j var också resistent mot NaOCl-oxidation, vilket är förknippat med att förhindra inflammation och nekros i celler.

Metabola vägar som fångar · O 2 - och släpper H 2 O 2

Den huvudsakliga metaboliska vägen för BA-j i makaker identifierades med LC-MS-MS. Den huvudsakliga metaboliska vägen involverade BA-j fånga 4-5 molekyler av · O 2 - och frisläppande 3-4 molekyler av H202 baserat på data som ges i fig. 5b, med sig själv nedbrytande till aktiv mellanproduktmetabolit dihydroflavonol, sedan medan att oxideras och bryts ned huvudsakligen till metaboliterna M179 och M264, såsom visas i fig. 95, 95% av BA som kom in i kroppen utsöndrades efter glukuronidering eller sulfation, och endast ett fåtal av BA-molekylerna fångade en molekyl av · O 2 - och släppte en molekyl av H2O 2 vardera, vilket således oxiderades 4-hydroxylpiperidin hade en stark aktivitet mot syrgasradikaler eftersom det fångade multimolekylära O2 - och frigav multimolekylärt H202 när det blev oxiderat och nedbrutet. Introduktion av 4-hydroxylpiperidinmetylen i BA-aktiverade flavonoidringar resulterade i enkel infångning av · O 2 - och självnedbrytning. Under tiden hämmades uppenbarligen den "enterohepatiska effluxeffekten" genom direkt glukuronidering och sulfation. Dessa resultat antyder att BA-j fångar · O2 - in vivo , bryts ned till M179 och M264 och frisätter H202, vilket är associerat med att öka den intracellulära H202-nivån i cancerceller. Denna metabola väg kan hämma BA-j "effluxeffekt" orsakad av direkt glukuronidering och sulfation. BA-js farmakokinetiska natur var bättre än BA.

Bild i full storlek

Diskussion

David Santamarıá et al. indikerade i sin artikel i Nature 2007 att CDK1 är det enda väsentliga CDK i cellproliferation. Dessutom kan CDK1, i frånvaro av CDF: s mellanfaser, utföra alla händelser som krävs för att driva cell1. När CDK1 fosforyleras i CDK1 (p-cdc2-Tyr15-Thr14) av Weel och Mytl-proteinkinas, defosforylerar CDC25C det till aktivt CDK1 (p-cdc2-Tyr15), som kombinerar Cyclin B1 och fosforylerar substratet Survivin i Survivin (p- Thr14), vilket således främjar cellerna till mitosfas 47 . År 2010 stod Jorrit M Enserink och Richard D Kolodner fram för att CDK1 skulle kunna användas som det senaste målet för anti-spridning av läkemedelsforskning 48 .

BA är känt för att ha selektiv hämmande förmåga mot CDK1, och hämmande aktivitet är svag mot andra kinaser 32 . Vi fann att BA-j som en substratförening för ATP direkt kan hämma aktiviteten för CDK1 som studerats av FRET, vilket är enzymaktivitetsbestämningsmetoden för CDK1 i icke-cancerceller, och den hämmande aktiviteten för BA-j (CC 50 0, 30 μM) mot CDK1 / Cyclin B1 är ungefär 20 gånger och 50 gånger starkare än BA och Baicalin. Eftersom 4-hydroxipiperidin som en potent antioxidant kan fånga multimolekyler av · O 2 - och frisätta multimolekyler av H202, modifierades BA strukturellt till BA-j av Mannich med 4-hydroxipiperidin och mjukhet hos BA-j är mer utmärkt. Det är värt att notera att det förstnämnda är aktivitetsbestämningsresultatet av CDK1-enzymet av celler utan cancer med användning av FRET-metoden, medan det senare är bestämningsresultatet i cancerceller in vitro av MTT. Principerna skiljer sig åt mellan dessa två metoder. Därför kan resultaten endast jämföras kvalitativt, men inte kvantitativt.

I Hep G2-celler grundade vi att BA-j selektivt kan hämma CDK1 / Cyclin B1, snarare än CDK2 / Cyclin E eller CDK4, 6 / Cyclin D. BA-j kan hämma CDC25C också med defosforylerande CDK1 (p-cdc2-Tyr15- Thr14) till aktiv CDK1 (p-cdc2-Tyr15). Eftersom BA-j kan fånga · O 2 - och selektivt öka nivån av H202 i cancerceller snarare än normala celler, vilket kan oxidera CDC25C, och defosforyleringen av CDK1 är hämmad, men inte andra CDK: er, vilket således hämmar cellproliferation.

Dessa resultat antyder att BA-j som en substratförening för ATP inte bara är en direkt hämmare av CDK1 / cyklin B, utan också en indirekt hämmare av CDK1 / cyklin B1 med H202 som oxiderar CDC25C snarare än av andra CDK: er. Därför är BA-j en ny selektiv CDK1-hämmare.

BA-j visade ett brett spektrum anti-canceraktivitet (IC 50 12, 3 μM, 4, 7 μg / ml) och ungefär fyra gånger starkare än BA (IC 50 50 μM) mätt med MTT 11 . Den anti-proliferativa aktiviteten hos BA och Baicalin är inte signifikant in vivo , på grund av deras dåliga biotillgänglighet genom "enterohepatiska effluxeffekter". Eftersom drubbarhet av BA-j är mer utmärkt än BA, kan BA-j signifikant minska tillväxten av SGC-7901 och H-460 xenografts (10 mg / kg, 10 dagar, > 75%). SFDA: s "riktlinjer för antitumörläkemedelsforskning" föreskriver att när IC 50- värdena av föreningar eller naturliga läkemedel som hämmar proliferation av cancerceller är mindre än 10 μg / ml respektive 20 μg / ml, anses de ha anticanceraktivitet in vitro . När tumörtillväxtinhiberingsgraden är mer än 40%, anses ett läkemedel ha betydande antitumöraktivitet in vivo . BA-j visade inga signifikanta biverkningar inom det terapeutiska dosområdet. Följaktligen tyder data på att BA-j har betydande antitumöraktivitet med hög effekt och lägre toxicitet. ROS är viktiga budbärare i cellsignaleringsprocesser och utgör den biokemiska grunden för många fysiologiska och patologiska svar. ROS inkluderar syrefria radikaler ( · O2 - ), hydroxylradikaler ( · OH - ), väteperoxid (H202), natriumhypoklorit (NaOCl), kväveoxid (NO), lipidperoxider (ROOH), över syrenitrit ( · ONOO - ) och så vidare. H202 har en hög diffusivitet och kan passera genom membranet. Höga halter H202 kan oxidera NaCl till NaOCl genom katalys med katalas (CAT).

Mekanismerna för redoxtillstånd är olika mellan normala celler och cancerceller. I normala celler, där aktiviteten för superoxiddismutas (SOD) är relativt hög, kan över 95% av den · O2-genererade fångas upp och komponeras till H202 av SOD. Därefter katalyseras överdrivet H2O2 och sönderdelas till H20 och 02 av glutation-enzym (GPX), som oxiderar glutation (GSH) till oxiderat glutation (GSSG); sålunda upprätthåller SOD och GPX relativt låga nivåer av O2- och H202, och cellerna förblir i ett icke-proliferativt tillstånd. Medan tumörceller är aktiviteten hos SOD och CAT svagare än i normala celler, vilket leder till ackumulering av · O2 -, vilket främjar cellproliferation och ökar känsligheten hos dessa celler för H202. Jämfört med normala celler är tumörceller mer sannolikt att induceras att genomgå apoptos med samma nivå av H202.

Carole Niccos forskargrupp från Faculté de Médecine, University Paris V demonstrerade för första gången att bland de antioxidanta enzymer som avgiftar H202 är glutathionvägen endast svagt involverad i kontrollen av H202-produktion av tumörceller, men spelar en viktig roll i kontrollen av H202-produktion i icke-transformerade celler. I normala celler hålls således ROS på låga nivåer på grund av att aktiviteten för NADPH-oxidas och H202-nivåerna regleras av glutation-systemet. Däremot produceras i tumörceller höga nivåer av ROS, nära tröskeln för cytotoxicitet, genom mitokondriell andningskedja, och H202-nivån kontrolleras av CAT. Denna upptäckt antydde för första gången att något medel som ökar den intracellulära H2O2-nivån kan bromsa cancerproliferation och leda till cellapoptos. Omvänt kan alla medel som sänker den intracellulära H2O2-nivån öka tumörtillväxten. H2O 2 spelar en viktig roll för att kontrollera ödet för normala celler och tumörceller. Därför kan läkemedel som specifikt ökar den intracellulära H202-nivån i cancerceller selektivt inducera cancer apoptos 46 .

The effects of ROS on cell proliferation depend on their nature, sub-cellular origin and intracellular level. The intracellular level of H 2 O 2 is critical because it easily reaches the threshold of toxicity in tumor cells. When some stimulation causes the H 2 O 2 level in tumor cells to climb high enough, kinases with their active site of cysteine can become oxidized, for instance, H 2 O 2 can cause depletion of the GSH content in cancer cells, target oxidation of CDC25, and inhibit activation of CDKs/Cyclins, suppressing proliferation 47 . H 2 O 2 also can specifically oxidize caspases, thus activating the apoptotic pathway of mitochondria and endoplasmic reticulum and selectively inducing apoptosis in tumor cells. At low levels, cytotoxic drugs can improve the intracellular H 2 O 2 level in cancer cells, oxidizing and activating the intrinsic apoptosis pathway. However, at high levels, they can stimulate mitochondria to produce NaOCl by H 2 O 2, oxidizing NaCl with CAT catalysis, thus activating the extrinsic death receptors pathway and causing cell inflammation and necrosis. Therefore, cytotoxic drugs damage normal cells while killing cancer cells 49 .

The molecular mechanism responsible for the selectivity of BA-j is a result of the differential regulation of ROS between normal cells and cancer cells, which allows BA-j to selectively induce apoptosis in cancer cells while protecting normal cells from inflammation and necrosis. In normal cells, the activity of SOD and GPX is high, and · O 2 levels are low. BA-j captures · O 2 and produces small amounts of H 2 O 2 that can be maintained at a very low level by GPX control, so the cells remain in a non-proliferative state. Whereas in cancer cells which have lower activity of SOD and CAT than normal cells, · O 2 is kept at a higher level. BA-j, similar to SOD, can capture · O 2 but produces more amounts of H 2 O 2, which is maintained at a higher level.

The higher level of H 2 O 2 can specifically oxidize kinases with active site of cysteine. For example, in cancer cells, H 2 O 2 can cause depletion of GSH content 50, target oxidation of CDC25, and inactivate CDKs/Cyclins, thus suppressing cancer proliferation 15, 19, 25, 32, 47 . H 2 O 2 can specifically oxidize and activate the intrinsic apoptosis pathway (ie, reduce the mitochondrial membrane potential, inhibit expression of Bcl-2, and activate caspase-8 and caspase-3, and therefore inducing apoptosis in cancer cells.

BA is known to have ROS-generating ability. However, the exact biochemical mechanism of BA regulating ROS is not understood. Because of their using of DCFH-DA, a non selective a probe, only the total ROS in cells was determined, but the differences among · O 2 , H 2 O 2 and NaOCl were not distinguished. Therefore, questions such as why BA is different from cytotoxic anti-cancer drugs which harm normal cells while killing cancer cells could not be explained 33, 51 .

In this paper, a novel method for assaying intracellular H 2 O 2 was designed by using the H 2 O 2 selective fluorescent probe PF1 52 . We First confirmed that BA-j can regulate ROS level (reducing · O 2 , increasing H 2 O 2, reducing NaOCl), but cytotoxic anti-cancer drugs can increase the ROS level (increasing · O 2 , H 2 O 2, and NaOCl). Because of the differential mechanisms controlling redox states in normal and cancer cells, BA-j can capture oxygen free radicals ( · O 2 ) and selectively increase the level of H 2 O 2 in cancer cells, thereby specifically oxidize some enzymes with active site of cysteine, specifically oxidize and activate the intrinsic apoptosis pathway. BA-j can also resist oxidation by NaOCl, bypassing the extrinsic death receptor pathway (ie, inactivate tumor necrosis factor receptor Fas/Fasl), which allows it to protect cells from inflammation and necrosis 16, 31 . BA-j showed a higher activity but similar molecular mechanism to BA; see Fig. 7. This mechanism of BA-j is different from cytotoxic anticancer drugs, which can activate both the intrinsic apoptosis pathway and the extrinsic death receptors pathway, and therefore harm normal cells while killing cancer cells.

( a ) Molecular mechanisms of H 2 O 2 –regulated cell proliferation and apoptosis. ( b ) Mechanisms of ROS regulation by BA-j. BA-j can selectively induce apoptosis in cancer cells and protect normal cells from inflammation and necrosis.

Bild i full storlek

Slutsats

The molecular and biochemical mechanisms of BA-j is the direct inhibition of CDK1 and capturing · O 2 and increasing level of H 2 O 2 in cancer cells rather than in normal cells. Higher level of H 2 O 2 is capable of specifically oxidizing kinases with cysteine at their active sites, such as oxidizing CDC25 with inactivating CDK1, and thus inhibiting proliferation cells, and oxidizing Caspases and activating the intrinsic apoptosis pathway thus inducing apoptosis in cancer cells rather than in normal cells. BA-j can also resist NaOCl oxidation, bypassing the extrinsic death receptor pathway, which allows it to protect cells from inflammation and necrosis. BA-j has broad-spectrum anticancer activity and can significantly reduce the growth of SGC-7901 and H-460 xenografts. These data provide evidence that BA-j may be developed into a novel anticancer drug.

Material och metoder

Ethical Statements

Animal experiments were conducted in accordance with the guidelines issued by the State Food and Drug Administration (SFDA of China). The research and protocol were approved by the Animal Care and Use Committee of Dalian Medical University in China. The animals were housed and cared for in accordance with the guidelines established by the National Science Council of Republic China. The present study was performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, NIH Publication No. 85–23, 1996). Briefly, male (6–8 week-old, 18–22 g, mixed-sex) BALB/c nude mice were provided by the Animal Care and Use Committee of Dalian Medical University in China.

Assay of intracellular H 2 O 2 by PF1

PF1 was designed as an intracellular H 2 O 2 selective fluorescent probe by Christopher J. Chang from the University of California-Berkeley. This probe is permeable through the cell membrane, stable and selective. PF1 is not fluorescent on its own, but it can be oxidized into yellow-green fluorescein FITC selectively by intracellular H 2 O 2, rather than by · O 2 or NaOCl. PF1 is currently the only truly effective tool for assessing intracellular H 2 O 2 levels induced by a drug 52 . A novel method to assay intracellular H 2 O 2 was designed using the selective H 2 O 2 fluorescent probe PF1 (synthesized by us), which was better than the non-selective ROS fluorescent probe DCFH-DA (2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate) 49 .

Determination method: cancer cells were seeded in a 96-well black-transparent micro-plate (1 × 10 5 cells/ml and 100 μl/well) and incubated at 37 °C in an atmosphere of 5% CO 2 for 30 h, or for 6 h in the case of normal cells. Then, 10 μl of a PBS-drug solution (drug was prepared as 4 mg/ml in DMSO and diluted with PBS to 500, 250, 125, 62.5, 31.25 and 0 μM) was added to 4 replicates. Cells were incubated for 3.5 h, then 10 μl of a PF1 fluorescent probes solution was added (a stock solution of PF1 was prepared as 1 mg/ml in DMSO and diluted with PBS to a 100 μM working solution), and cells were further incubated at 37 °C for 0.5 h while the micro-plate was shielded by foil. The fluorescence intensity was detected using fluorescence ELISA (excitation wavelength 488 nm, emission wavelength 525 nm), and the H 2 O 2 concentration was calculated. For adherent cells, the foil and the media were removed, and the cells were washed with 200 μl PBS before being subjected to intracellular H 2 O 2 fluorescence imaging via the fluorescence microscope. For suspended cells, 200 μl PBS was added to the media, and after 5 min, cells from the bottom of each well were collected and plated on glass coverslips and subjected to intracellular H 2 O 2 fluorescence imaging via the fluorescence microscope.

Standard curve and quantitative limits: 90 μl of plasma culture media was added to each well, and then 10 μl of a PBS-H 2 O 2 solution (H 2 O 2 solution was diluted with PBS to 500, 250, 125, 62.5, 31.25 and 0 μM) was added to 4 replicates. Next, 10 μl of a 100 μM PF1 fluorescence probes solution was added, and micro-plates were shaken for 0.5 h at 37 °C. Then, the fluorescence intensity was measured and the standard curve was drawn.

The concentration of H 2 O 2 in the plasma media ranged from 3 to 100 μM, and each well was treated with 10 μM PF1. With the square root of the blank correcting fluorescence OD differences as the abscissa (X), and the concentration of H 2 O 2 (μM) as the ordinate (Y), Linear regression equation: Y = 0.592X (R 2 = 0.995, n = 6) was derived, and a good linear relationship was observed.

CDK1/Cyclin B1 inhibition assay by FRET

The quantitative analysis technique of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) was adopted for screening the CDK1/Cyclin B inhibitory activity of the flavonoid Mannich base derivatives. Generally, the test compounds were prepared as 1 mg/ml DMSO solutions and diluted with DMSO into 8 geometric concentrations (3-fold). CDK1/Cyclin B inhibitory activities were measured by a fluorescence kinetic assay and CC 50 values were calculated according to the instructions of the CDK1/Cyclin B kit (Invitrogen, USA) 44 .

Cell kultur

Breast (MCF-7 [TCHu 74] and MDA-MB-231 [TCHu104]), cervical (Hela [TCHu187]), hepatoma (SMMC-7721 [TCHu 52] and Hep G2 [TCHu 72]), gastric (SGC-7901 [TCHu 46] and BGC-823 [TCHu 11]), prostate (PC-3 [TCHu158]), leukemia (HL-60 [TCHu 23] and K562 [TCHu191]), non–small cell lung carcinoma (H-460 [TCHu205]), and colon (HCT-116 [TCHu 99]) cancer cell lines were purchased from the Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China). The catalogue number of each cell line is indicated in the bracket following its name.

The cell lines were seeded in 4 × 6 cm flasks and cultured in DMEM (Sigma) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Gibco), 100 U/ml Penicillin and 100 μg/ml streptomycin in a water-saturated atmosphere of 5% CO 2 at 37 °C. The culture medium was changed every 48 h and cells were sub-cultured approximately once every 96 h. For sub-culturing, the medium was discarded, and the appropriate amount of 0.25% trypsin was added for a 2–3 min digestion at 37 °C. Observed under the microscope, these cells tended to become round. 10% FBS was added to terminate the digestion, and the cell solution was gently beaten with a straw several times so that cells were detached from the culture bottle wall and completely dispersed. These cells were divided into cell culture flasks and the appropriate amount of medium was added for further culture. For HL-60 cells, part of the medium was discarded leaving the appropriate amount of cells and medium, and fresh medium was added. For plating experiments, cells were observed and counted under the microscope, and cells in the logarithmic growth phase were used. RPMI 1640 medium was added for dilution, and cells were counted under the microscope and adjusted to 1 × 10 5 cells/ml.

Normal human primary hepatocytes (Liver) were purchased from the Dalian Institute of Physical Chemistry (Dalian, China). Liver was cut into small pieces and digested with the appropriate amount of 0.25% trypsin at 37 °C for 2–3 min. Observed under the microscope, these cells tended to become round. 10% FBS was added to terminate the digestion, and the cell solution was gently beaten with a straw several times so that cells were detached from the culture bottle wall and completely dispersed. RPMI 1640 medium was added for dilution, and the cells were counted under the microscope and adjusted to 1 × 10 5 cells/ml.

Normal human peripheral blood was purchased from the Dalian city blood bank and approved by the human blood use committee of the Dalian city blood bank in China. Normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from heparinized venous blood of healthy volunteers by Ficoll–Paque density gradient centrifugation. After anticoagulation by heparin, 1 ml of fresh human peripheral blood was washed with PBS twice, and then 1 ml of Ficoll-PM400 was carefully added into the bottom of the test tube, forming a single layer. After 1000 r/min centrifugation for 7 min, the intermediate buffy coat layer was separated. RPMI 1640 medium was added for dilution, and the cells were counted under the microscope and adjusted to 1 × 10 5 cells/ml.

Proliferation assay by MTT

Cells were seeded in 96-well micro-plates (5 × 10 3 cells/well, HL-60 1 × 10 4 cells/well) and incubated at 37 °C for 24 h. In dark conditions, BA-j-DMSO solutions were diluted with PBS and added to the appropriate wells with final concentrations of 0, 5, 10, 20, and 40 μM, with 4 replicates of each condition. For the control, PBS containing 0.1% DMSO was added instead of the BA-j solution. The micro-plates were incubated at 37 °C for 48 h, and then the media were removed. 100 μl of a 0.5 mg/ml MTT solution diluted with PBS was added to the wells, and the micro-plates were further incubated for 3 h. After incubation, the MTT solution was removed, and 100 μl of DMSO was added to each well to dissolve the formazan. Micro-plates were read at 570 nm (630 nm as a reference) by a micro-plate reader (Sunrise, TECAN, Austria), according to Tim Mosmann's method.

Tumor xenograft model

Human gastric carcinoma (SGC-7901) cells were chopped into fragments (approximately 1.5 mm), each of which was transplanted sc into the right axillary fossa of BALB/c nude mice. Human non–small carcinoma (H-460) cells were grown in RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum and harvested. Cells were resuspended in saline at 2.5 × 10 7 cells/ml and placed on ice. Severe combined immunodeficient mice were injected with a 0.2 ml cell suspension sc on the right flank and observed daily for tumor appearance. When the tumors attained a diameter of 5 mm, tumor xenograft models were randomized into two groups (n = 9). For 10 days, a 10 mg/kg BA-j mesylate injection was orally administered twice daily in the test group, and water was administered in the control group. Animals in both models were observed daily for signs of health deterioration and mortality for 30 days. Tumor size was measured once every 5 days in two perpendicular dimensions with vernier calipers and converted to tumor volume (TV) using the formula: (ab 2 )/2, where a and b refer to the longer and shorter dimensions, respectively. The body weight of the animals was measured once every 5 days, concurrently with the tumor dimension measurements. After observation for 30 days, mice were euthanized by cervical dislocation (this method of animal sacrifice is in accordance with the criteria set up by the Animal Care and Use Committee of Dalian Medical University in China) and weighed, and the tumor was segregated and weighed. No signs of ill health, pain, or suffering were observed, and therefore no action was taken to minimize suffering. There were no obvious adverse effects or mortality during the experiment.

Morphological observation of nuclear change

Hoechst 33258 staining method was adopted for analysis under dark conditions. Cells were seeded in 96-well micro-plates (1 × 10 6 cells/ml, 100 μl/well), and pre-incubated at 37 °C. Then, different concentrations (10, 20 and 40 μM) of BA-j were added, and the micro-plates were further incubated for 48 h. For staining, media were removed and cells were washed with PBS 3 times before being fixed in 0.5 ml of cold, 4% paraformaldehyde for 30 min at room temperature. Then, fixative was removed, and cells were washed with PBS 3 times, stained with 0.5 ml of 10 μg/ml Hoechst 33258 (Sigma) at 37 °C for 10 min, and incubated at 37 °C in 5% CO 2 for 10 min. The presence of nuclear morphological changes in the cells was observed with an Olympus fluorescence microscope fitted with a UV excitation filter (Tokyo, Japan).

Cellcykelanalys

Propidium iodide (PI), which binds DNA, was used for staining analysis. Cells were seeded in flasks (5 × 10 4 cells/ml, 3 ml/flask), and cultured for 24 h in the dark. Then, different concentrations (10, 20 and 40 μM) of BA-j were added, and the micro-plates were further incubated for 48 h. After culturing, cells were collected (approximately 1 × 10 4 ), centrifuged at 1000 r/min for 5 min, and washed with cold PBS 3 times. Next, cells were fixed in 70% cold ethanol at 4 °C overnight. Then, fixative was removed, cells were washed with PBS twice, and incubated with DNase-free RNase (100 μg/ml) at 37 °C for 30 min. After incubation, the cells were re-suspended in 10 μg/ml PI (Sigma) solution and incubated at 4 °C for another 30 min in the dark, and then subjected to cell cycle analysis using flow cytometry. Flow cytometry (BD FACS cantoTM, USA) was used to detect cells in different phases of the cell cycle, and the percentages of cells in G1, S, and G2 phases were calculated using ModFit LT 3.0 software.

Apoptosis assay

Annexin V-FITC antibody immunofluorescence combined with PI/DNA binding was adopted for fluorescent analysis of apoptosis. Cells (2 × 10 5 ) were collected and subjected to quantitative flow cytometry analysis according to the instructions of the Annexin V-FITC kit (BioVision, USA).

Assay of Bcl-2 and Bax expression

Immunofluorescence was used to analyze Bcl-2 and Bax protein expression. Cells (1 × 10 6 ) were washed with cold PBS 3 times, fixed with 4% paraformaldehyde at 4 °C for 20 min, and then incubated with 0.5% TritonX-100 and 1% bovine serum albumin for 10 min. The cells were then washed with PBS twice, followed by the addition of primary antibodies against Bcl-2 or Bax (Santa Cruz) and further incubation at 37 °C for 1 h. Next, the cells were washed with PBS twice and incubated with the corresponding fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated secondary antibodies at room temperature for 45 min in the dark. The cells were washed with PBS again, and the antigen density was analyzed by flow cytometry as described with minor modifications.

Assay of mitochondrial membrane potential

Mitochondrial membrane potential (MMP) changes were detected and analyzed with the Rhodamine 123 detection kit (Rh123, Nanjing Keygen Biotech., China). Cells (1 × 10 6 ) were incubated with 10 μg/ml Rh123 solution for 10 min at 37 °C in an atmosphere of 5% CO 2 . After incubation, the cells were washed twice with PBS to remove free Rh123, and then incubated in PBS for 60 min at 37 °C in an atmosphere of 5% CO 2 . The fluorescence intensity of Rh123 was measured immediately with Thermo Scientific Varioskan Flash (Thermo Scientific, USA) using excitation and emission wavelengths of 500 nm and 530 nm, respectively.

Caspase activity assay

Because the emission spectrum of free p -nitroaniline can be detected by a micro-plate reader at 405 nm, caspase activity can also be determined. A caspase-8 and caspase-3 colorimetric assay kit (Nanjing KeyGen Biotech., China) was used to determine caspase activity. Cells (2 × 10 6 ) were collected in a 1.5 ml centrifuge tube and lysed by 10 min incubation with 50 μl lysis buffer on ice. After 1000 r/min centrifugation at 4 °C for 1 min, the supernatant (ie, cytoplasmic extract) was carefully pipetted into another tube and kept on ice. The protein concentration of each sample was determined using the Bradford method. Then, according to the protein level of each sample, certain amounts of protein (50–200 μg) were diluted in 50 μl cell lysis buffer for the next step of the experiment. Next, 50 μl of 2× reaction buffer (containing 10 mM DTT) and 5 μl of 4 mM DEVD p -nitroaniline (final concentration 200 μM) were added, and lysates were incubated at 37 °C for 4 h, then transferred into a 96-well micro-plate and read at 40 nm by a micro-plate reader.

Western blot-analys

Hep G2 cells (2 × 10 6 ) were lysed, and their protein content was separated by SDS-PAGE and electrophoretically transferred onto a PVDF membrane (Millipore). The membrane was blocked with 5% nonfat milk in TBST buffer and incubated overnight at 4 °C with specific primary antibodies, including anti-human Fas and FasL antibodies (Transduction Laboratory, USA). The membrane was washed with TBST buffer and incubated with the appropriate secondary antibody (horseradish peroxidase-conjugated goat-antimouse IgG). Determinations were performed using enhanced chemiluminescence kits (Amersham Biosciences, USA).

The membrane was blocked with 5% nonfat milk in TBST buffer and incubated overnight at 4 °C with specific primary antibodies, including anti-human CDC25C, CDK1 (p-cdc2-Tyr15-Thr14), CDK1 (p-cdc2-Tyr15), CDK2, CDK4, CDK6, Cyclin B1, Cyclin D, Cyclin E antibodies. The membrane was washed with TBST buffer, incubated with the appropriate secondary antibody (goat-antimouse IgG/ FITC), and the membrane was washed with TBST buffer. Differences in protein level were determined for conjugated goat-antimouse IgG/FITC by densitometric scanning (Quantity One software package, Biorad) and normalized using internal standards (ie, β-actin) 32 .

Statistisk analys

Data are expressed as the mean ± SEM from 4 repeated experiments and were evaluated using a one-way ANOVA. Differences are considered significant when P < 0.05.

ytterligare information

How to cite this article : Zhang, S. et al. BA-j as a novel CDK1 inhibitor selectively induces apoptosis in cancer cells by regulating ROS. Sci. Rep. 5, 13626; doi: 10.1038/srep13626 (2015).

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapens riktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.