Atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom har ofta mutationer 1/2 och fett1 och liknande förändringsprofiler för DNA-kopieringsnummer | modern patologi

Atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom har ofta mutationer 1/2 och fett1 och liknande förändringsprofiler för DNA-kopieringsnummer | modern patologi

Anonim

ämnen

  • Genetikforskning
  • Translational research

Abstrakt

Atypiska fibroxantomer och pleomorfa dermalsarkom är tumörer som uppstår i solskadad hud hos äldre patienter. De har olika prognoser och skiljer sig för närvarande med hjälp av histologiska kriterier, såsom invasion av djupare vävnadsstrukturer, nekros och lymfovaskulär eller perineural invasion. För att undersöka den ännu inte förstått genetiken hos dessa tumörer, utsattes 41 atypiska fibroxantomer och 40 pleomorfa dermalsarkom för målinriktade nästa generations sekvenseringsmetoder samt DNA-kopienummeranalys genom jämförande genomisk hybridisering. I en analys av hela den kodande regionen av 341 onkogener och tumörundertryckningsgener i 13 atypiska fibroxantomer med användning av en etablerad hybridiseringsbaserad nästa generations sekvenseringsmetod, fann vi att dessa tumörer har ett stort antal mutationer. Genförändringar identifierades i mer än hälften av de analyserade proverna i FAT1 , NOTCH1 / 2 , CDKN2A , TP53 och TERT- promotorn. Närvaron av dessa förändringar bekräftades i 26 atypisk fibroxantom och 35 pleomorf dermal sarkomprov genom målinriktad amplikonbaserad nästa generations sekvensering. Liknande mutationsprofiler i FAT1 , NOTCH1 / 2 , CDKN2A , TP53 och TERT- promotorn identifierades i både atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom. Aktiverande RAS- mutationer (G12 och G13) identifierade i 3 pleomorfisk dermal sarkom hittades inte i atypisk fibroxantom. Omfattande DNA-kopianummeranalys visade ett brett spektrum av olika vinster och förluster av kopianummer, med liknande profiler i atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom. Sammanfattningsvis är atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom mycket muterade tumörer med återkommande mutationer i FAT1 , NOTCH1 / 2 , CDKN2A , TP53 och TERT- promotorn och ett antal DNA-kopieringsnummerförändringar. Dessa fynd antyder att atypiska fibroxanthomas och pleomorfa dermalsarkom är genetiskt relaterade, potentiellt representerar två ändar av ett gemensamt tumörspektrum och att urskilja dessa enheter för närvarande bäst utförs med histologiska kriterier.

Huvudsaklig

Atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom är sällsynta mesenkymala tumörer som vanligen uppstår i solskadad hud hos äldre patienter. Patogenesen för dessa tumörer är inte väl förstått.

Atypisk fibroxantom är tumörer som förekommer i solskadad hud, främst i huvud- och nackregionen hos äldre patienter. 1, 2, 3, 4 Mer frekvent hos män är dessa tumörer ofta väl omskriven, snabbt växande och visar ett exofytiskt tillväxtmönster. Kända riskfaktorer inkluderar UV-exponering, bestrålning, xeroderma pigmentosum och organtransplantation. 5 Histologiskt består tumörerna av atypiska spindlade och pleomorfa tumörceller, inklusive tumörjättceller. Tumörer kan i huvudsak lokaliseras i dermis och har begränsad utsträckning till subkutis. Hög mitotisk aktivitet är vanligt med presentation av ofta atypiska mitotiska figurer. 2 Atypisk fibroxantom invaderar inte den djupa mjuka vävnaden, och trots ökad proliferativ aktivitet observeras inte histologiska egenskaper såsom nekros, och lymfovaskulär och / eller perineural invasion. En diagnos av atypisk fibroxantom kräver uteslutning av andra neoplasmer, i synnerhet melanom, skivepitelcancer och leiomyosakrom. Atypisk fibroxantom har vanligtvis en god prognos, och vanligtvis rekommenderas fullständigt excision och regelbunden uppföljning. 1

Pleomorfa dermala sarkom demonstrerar liknande morfologi som atypisk fibroxantom, men uppvisar mer aggressiva histologiska egenskaper såsom omfattande involvering av subkutis och / eller djupare strukturer, områden med tumornekros och lymfovaskulär eller perineural invasion. 6 Pleomorfisk dermal sarkom uppvisar mer aggressivt kliniskt beteende än atypiskt fibroxantom och kategoriseras som tumörer med låg grad av malign potential baserat på deras potential för lokal återfall och metastas. 7 Tumörerna som nu definieras som pleomorf dermal sarkom har också tidigare kallats kutana odifferentierade pleomorfa sarkom eller som ytliga maligna fibrösa histiocytom tidigare. 8, 9, 10 Det finns fortfarande en brist på effektiva behandlingar för metastaserad pleomorf dermal sarkom.

Att särskilja atypisk fibroxantom från pleomorf dermal sarkom är avgörande på grund av deras skillnader i kliniskt beteende. Att diskriminera dessa enheter baserat på cellmorfologi enbart är inte möjligt eftersom deras cytologiska egenskaper är liknande. Histologiska kriterier som tillämpas för att särskilja pleomorf dermal sarkom från atypisk fibroxantom är följande: större tumörstorlek; omfattande infiltration av subkutis, invasion av fascia eller muskler; nekros; och vaskulär eller perineural invasion. 2, 6 Försök att skilja mellan atypiskt fibroxantom och pleomorf dermal sarkom baserat på biopsiprover bör undvikas eftersom dessa kanske inte visar den djupaste graden av tumörengagemang eller missar histologiska kriterier som nekros eller vaskulär / perineural invasion som finns i andra områden i tumören. . Försök att identifiera immunohistokemiska markörer som underlättar distinktionen av atypiskt fibroxantom från pleomorf dermal sarkom (t.ex. CD99 och LN-2 (ref 11, 12) har inte visat sig vara användbara vid rutinmässig praxis. 1, 2, 3, 13

Lite är känt om de genetiska händelserna som leder till utvecklingen av atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom. Tidigare mindre studier identifierade UV-signaturmutationer i TP53 vid atypisk fibroxantom (7/10 (ref. 14) och 4/6 (ref. 15) fall) och pleomorf dermal sarkom (1/4 fall, diagnostiserat som 'malignt fibröst histiocytom') 15 ), samt en HRAS- och en KRAS- mutation i 8 pleomorfisk dermal sarkom (diagnostiserad som 'malignt fibröst histiocytom') analyseras. 16 I en annan studie visade sig att pleomorfisk dermal sarkom (diagnostiserad som 'odifferentierad pleomorf sarkom') innehöll mer frekventa DNA-kopieringsnummerförändringar än atypisk fibroxantom. 17 Vi har rapporterat höga frekvenser av TERT- promotormutationer i atypiskt fibroxantom och pleomorf dermal sarkom. 18 En nyligen genomförd studie av 5 atypisk fibroxantom och 5 pleomorfisk dermal sarkom demonstrerade frekventa TP53- mutationer, liksom individuella CDKN2A- , HRAS- , KNSTRN- och PIK3CA -genmutationer. 19

Målet med vår studie var att försöka identifiera återkommande genmutationer i atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom genom att använda nyare sekvenseringsteknologier och genomomfattande DNA-kopianummeranalys. Förutom att generellt få en bättre förståelse av patogenesen hos dessa tumörenheter, försökte vi bestämma om genetiska förändringar kan vara ett ytterligare diagnostiskt hjälpmedel för att skilja dessa tumörer.

Material och metoder

Provval

Atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom tumörprov erhölls från vävnadsarkiven i Dermatopatologi Duisburg (24 atypisk fibroxantom) och Dermatopatologi Friedrichshafen (17 atypisk fibroxantom och 20 pleomorf dermal sarkom), Tyskland, såväl som från General Hospital of Western Path, University of Edinburgh, Edinburgh, UK (20 pleomorfisk dermal sarkom, som tidigare beskrivits av Miller et al. 7 ). Studien gjordes i enlighet med de riktlinjer som fastställts av etiska kommittén vid universitetet i Duisburg-Essen.

Histopatologi och immunohistokemi

Histologiska sektioner av alla tumörer granskades och diagnoserna bekräftades av minst två dermatopatologer (TB, TM, KGG och JS). Tillgängliga kliniska och patologiska data analyserades, inklusive ålder, kön, plats, storlek, djup, polyploidarkitektur, tumör-mitotisk hastighet, ulceration, nekros, invasion av subcutis, invasion av slät muskel eller fascia, infiltrativ eller tryckande gräns, lympovaskulär invasion och perineural invasion . Immunohistokemiska markörer applicerade på alla tumörer, inklusive följande: pan-cytokeratin (MNF116; 1/500, AE1 / AE3; 1/50); CD31 (JC70A; 1/100) eller CD34 (QBEnd-10; 1/50); S100 (polyklonal; 1/2000); desmin (D33; 1/100); glattmuskelaktin (ASMA 1A4; 1/500); och Melan-A (A103; 1/1000). De beskrivna antikropparna erhölls från DAKO Hamburg / Tyskland (Duisburg och Friedrichshafen fall). Fläckar i fallen från Edinburgh utfördes som beskrivits tidigare. 7

DNA-isolering

De 10 um tjocka sektionerna skars från formalinfixerade, paraffin-inbäddade tumörvävnader. Avsnitt deparaffiniserades och tumörbärande områden manuellt makroskissades enligt rutinprocedurer. Isolering av genomiskt DNA utfördes med användning av QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner.

DNA-kopienummeranalys

Array-baserad jämförande genomisk hybridisering användes för att utföra analys av DNA-kopianummeravvikelser. Metoderna för hybridisering och analys, inklusive statistisk analys av GISTIC 2.0, har beskrivits tidigare. 20, 21, 22, 23 I enskilda fall utfördes hela genomförstärkningen med användning av Sigmas GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit som beskrivits tidigare. 24

Hybridiseringsfångstbaserad nästa generations sekvensering för kända onkogenmutationer

Anpassade DNA-prober designades för målinriktad sekvensering av alla exoner och utvalda introner av 341 onkogener och tumörundertryckningsgener (MSK-IMPACT-analys). 25 Kortfattat användes genomiskt DNA från tumörprover för att framställa streckkodade bibliotek med användning av KAPA HTP-protokollet (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA) och Biomek FX-systemet (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Bibliotek samlades, fångades och sekvenserades därefter på ett Illumina HiSeq 2500-system som parlästa läsningar. Sekvenserade läsningar trimmades för att avlägsna vestigialadaptersekvenser med användning av TrimGalore, 26 och anpassades till hg19-mänskligt referensgenom med användning av BWA. 27 PCR-duplikat avlägsnades från inriktningsutgången och de inriktade läsarna utsattes för lokal indeljustering och återkalibrering av baskvalitet med användning av GATK. 28 Somatic variant-samtal utfördes med användning av MuTect 29 för enkel-nukleotidvarianter (SNV) och SomaticIndelDetector 28 för indels. Betydande vinster och förluster med kopieringsnummer upptäcktes genom att kräva en större än tvåfaldig förändring i normaliserad täckning mellan tumör och en komparatorreferens nyfryst paraffininbäddad normal. Somatiska strukturvarianter detekterades med användning av DELLY, 30 som krävde både parad ände och split-read-stöd.

Amplicon-baserad inriktad nästa generations sekvensering (Amplicon nästa generations sekvensering)

En anpassad amplikonbaserad sekvenseringspanel som täcker 11 gener ( HRAS , KRAS , NRAS , CDKN2A , FAT1 , KNSTRN , TP53 , NOTCH1 , NOTCH2 , PIK3CA och TSC2 ) designades (tabell 1). Denna panel inkluderade de gener som oftast hittats muterade i atypisk fibroxantom i vår tidigare screening (påverkar nästa generations sekvensering), såväl som RAS- generna, som tidigare rapporterats vara muterade i pleomorf dermala sarkom. 16 Biblioteksförberedelser utfördes med tillämpning av GeneRead Library Prep Kit från QIAGEN enligt tillverkarens anvisningar. NEBNext Ultra DNA Library Prep Mastermix Set och NEBNext Multiplex Oligos för Illumina från New England Biolabs användes för adapterligering och streckkodning av enskilda prover. Sekvensering utfördes på en Illumina MiSeq nästa generations sequenser, sekvenserande upp till 24 prover parallellt. Med sekvensering av provkohorten uppnåddes en genomsnittlig täckning av 2803 läsningar med 82% av målområdet med en minimitäckning på 30 läsningar.

Full storlek bord

Sekvensanalys

CLC Cancer Research Workbench från QIAGEN applicerades som tidigare rapporterats 31 för sekvensanalys. I korthet inkluderade CLC-arbetsflödet adapterklippning och läsparets sammanslagning innan det mappades till det mänskliga referensgenomet (hg19). Därefter följde insättningar och borttagningar såväl som SNV-upptäckt, lokal inriktning och primer-trimning. Olika databaser korsreferenserades (COSMIC, ClinVar, dbSNP, 1000 Genomes Project, HAPMAP och PhastCons-Conservation_scores_hg19) beträffande information om mutationstyp, enkel-nukleotidpolymorfismer och bevaringsresultat. Csv-filer analyserades ytterligare manuell screening med avseende på proteinkodande mutationer som förutsägs resultera i icke-synonyma aminosyraförändringar. Mutationer övervägs om den totala täckningen av mutationsstället var> 30 läsningar, ≥10 läser rapporterade den muterade varianten och frekvensen för muterade läsningar var> 10%.

Direkt (Sanger) sekvensering

PCR-amplifiering av TERT- promotorregionen utfördes såsom tidigare beskrivits. 18 PCR-produkter renades med QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) och användes som mallar för sekvensering. Sekvenseringskromatogramfilerna undersöktes med användning av Chromas-programvara (version 2.01, University of Sussex, Brighton, UK) eller Sequencher-programvara (version 5.1, Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA).

Föreningar av genmutationsstatus med kliniska och patologiska parametrar

Vi undersökte föreningar av mutationsstatus med tillgängliga kliniska och patologiska parametrar med användning av icke-parametriska test, χ 2- tester och exakta tester från Fisher vid behov. Alla statistiska analyser utfördes med användning av programvaran PASW Statistics 18 (International Business Machines, Armonk, NY, USA). En P- värde av ≤0, 05 ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

Studera kohorten

Sammantaget analyserades 81 (41 atypisk fibroxantom och 40 pleomorf dermal sarkom), varav 77 var primära tumörprover och 4 var återkommande pleomorf dermal sarkom. Totalt 67 patienter var manliga och 14 kvinnliga. Medianåldern vid diagnos var totalt 82 (intervall 47–102) år; 79 (intervall 65–93) år för atypisk fibroxantom och 84 (intervall 47–102) år för pleomorf dermal sarkom. En översikt över de olika genetiska analyserna som tillämpas på varje prov ges i tilläggstabell 1.

Kliniska och patologiska egenskaper hos atypiskt fibroxantom och pleomorf dermal sarkom

Kliniska och patologiska egenskaper listas i tabell 1. Tumörer var negativa för de flesta listade immunohistokemiska markörer. Fokalt eller patchy glatt muskelaktinuttryck sågs hos 14 (34%) atypiskt fibroxantom och 11 (28%) pleomorf dermal sarkom. Som tidigare rapporterats visade 7 10 (25%) pleomorf dermal sarkomfall fokal uttryck av CD31 och 1 pleomorf dermal sarkom uppvisade begränsat avvikande uttryck av Melan-A (S100 var negativt).

Genomiska resultat

Hybridiseringsfångstbaserad nästa generations sekvensering för kända onkogenmutationer

Ett betydande antal mutationer identifierades i de 13 atypiska fibroxantomtumörproverna som analyserades med ett totalt genomsnittligt sekvenseringsdjup av 492 gånger. Det genomsnittliga antalet mutationer som identifierats i varje prov var 55, intervallet var mellan 34 och 94 mutationer. Gener muterade i mer än 3 tumörer visas i figur 1 (alla identifierade mutationer listas i kompletterande tabell 2). Särskilt ofta var TP53- mutationer, identifierade i alla prover, med 10/13 (77%) prover som innehöll inaktiverande mutationer. TERT- promotormutationer identifierades i 12/13 (92%) prover. I FAT1 inaktiverade 8 av 13 (62%) prover mutationer, 7 (87, 5%) inaktiverade. Andra uppenbara förändringar påverkade CDKN2A med 6 av 13 (46%) mutationer, 5 (83%) inaktiverande. NOTCH1 muterades i 11 av 13 (85%) prover, även med 5 (45%) inaktiverande mutationer (5). Även om panelen täcker de mest kända aktiverande mutationerna i mänsklig cancer, 25 identifierades inga återkommande kända funktionellt aktiverande proteinkodande mutationer i dessa tumörer.

Fördelning av mutationer i atypiska fibroxantomer. Påvisade är data från 13 atypiska fibroxantomer sekvenserade med en hybridiseringsbaserad skärm som täcker 341 onkogener och tumörundertryckare. Alla exoner av generna analyserades. De gener som presenteras är de som har visat sig ha muterats i minst 3 prover. Mutationstypen är enligt legenden. Ingen mutation identifierad (vild typ) indikeras av ingen fyllning, missense-mutationer av oklart konsekvens av gråfyllda rutor, funktionsförlust (icke-sense eller frameshift) mutationer är markerade med röda fyllda rutor och aktivering av mutationer i TERT- promotorn av blåfyllda lådor.

Bild i full storlek

Riktad amplikonbaserad nästa generations sekvensering (amplikon nästa generations sekvensering)

För att ytterligare utvärdera och validera fördelningen av många av de identifierade återkommande mutationerna designades och applicerades en anpassad panel som täckte de mest muterade generna (tabell 1). Förutom gener identifierade i den beskrivna skärmen för onkogenmutationer, inkluderades RAS- generna, som tidigare rapporterats vara muterade i pleomorf dermal sarkom, 16 och KNSTRN , en gen rapporterad muterad i skivepitelcancer, 32 inkluderade i panelen. Totalt sekvenserades 26 atypisk fibroxantom och 35 pleomorfisk dermal sarkom. Mutationsprofilerna för båda tumörenheterna var liknande (figur 2; kompletterande tabell 3). Högt antal TP53- mutationer i 22/26 (85%) atypisk fibroxantom och 31/35 (89%) pleomorf dermal sarkom, NOTCH1- mutationer i 14/26 (54%) atypisk fibroxantom och 22/35 (63%) pleomorf dermal sarkom), NOTCH2- mutationer i 11/26 (42%) atypisk fibroxantom och 17/35 (49%) pleomorf dermal sarkom, samt FAT1- mutationer i 15/26 (58%) atypisk fibroxantom och 24/35 (69%) pleomorf dermal sarkom identifierades. Mindre frekvent detekterade var TSC2 , PIK3CA och CDKN2A- mutationer (figur 2).

Fördelning av mutationer i atypiska fibroxantomas och pleomorfa dermalsarkom. Dessa presenteras är resultaten från den amplikonbaserade sekvenseringsmetoden. Alla gener som screenas för i ampliconpanelen presenteras. Identifierad mutationstyp presenteras i figurlegenden.

Bild i full storlek

UV-signatur mutationsanalys

För att bedöma UV-exponeringens roll i patogenesen av atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom utfördes en analys av mutationer som identifierats i TP53- genen och bedömde mängden potentiellt UV-inducerade mutationer. En metod som tidigare har använts för hudtumörer. 14, 33, 34, 35 I 61 tumörer identifierades 93 mutationer i TP53 , 37 i 25 atypisk fibroxantom och 56 i 36 pleomorf dermal sarkom. Frekvensen av mutationer med en UV-signatur var hög i båda tumörer, varvid C> T (G> A) och CC> TT (GG> AA) mutationer detekterades i 43% (16/37) och 14% (5/37) ) av mutationer i atypiskt fibroxantom och 57% (32/56) och 7% (4/56) av mutationer i pleomorf dermal sarkom.

TERT- promotor

TERT- promotorn analyserades genom Sanger-sekvensering såsom tidigare beskrivits. 18 Majoriteten av tumörerna 19/20 (95%) atypisk fibroxantom och 18/24 (75%) pleomorf dermal sarkom där sekvensering var framgångsrik, visade minst en känd aktivering av hot-spot mutation i TERT- promotorn.

Kopiera nummerändringar

Information om kopienummer utfördes genom jämförande genomisk hybridisering i 42 prover, 20 atypisk fibroxantom och 22 pleomorfa dermala sarkomprover. De totala resultaten visas i figur 3. Tumörer visade ett betydande antal förändringar. Tydliga skillnader i termer av förändringsprofiler mellan atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom var inte synliga. Vanliga var förluster på 8p, 9p och 9q. Större raderingar som involverar de flesta av Chr. 13, 16 och 18 var också uppenbara. Vinsterna var dock mindre ofta identifierade i Chr. 1q, 8q, 17q och 19p. Förändringsprofilen var mycket lik vid atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom (figur 3).

Kopiera nummerprofiler i atypiska fibroxantomer och pleomorfa dermalsarkom. Här visas de jämförande genomiska hybridiseringsresultaten av 20 atypisk fibroxantom som visas ovanpå, 22 pleomorfa dermalsarkom som visas i mittpanelen och alla 42 prover tillsammans, visade på bottenpanelen. Alla grupper analyserades identiskt med Agilent-programvaran. Förändringar visas som inträngningsdiagram, vinster i rött, förluster i grönt.

Bild i full storlek

Föreningar av klinikopatologisk och mutationsstatus vid atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom

Den fullständiga analysen presenteras i tabell 2. Histologiska kriterier som användes för att särskilja atypisk fibroxantom från pleomorf dermal sarkom visade sig vara tydligt associerade med tumörtyp, inklusive följande: nekros ( P <0, 001); invasion till subcutis ( P <0, 001); invasion i fascia / skelettmuskulatur (<0, 001); gräns ( P <0, 001); lymfovaskulär invasion ( P = 0, 001); och perineural invasion ( P <0, 001). Skillnader i termer av genmutationsstatus mellan atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom som visats i tabell 3 visade sig inte vara statistiskt signifikant. En analys av genmutationsstatus med individuella histopatologiska kriterier (kompletterande tabell 4) visade inga korrelationer med mutationsstatus med undantag för ålder med NOTCH2 ( P = 0, 05), tumördjup med TP53 ( P = 0, 05) och nekros med TERT- promotor ( P = 0, 002) mutationsstatus (visas i detalj i tilläggstabell 4).

Full storlek bord

Full storlek bord

Diskussion

De genetiska grunden för atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom, liksom förhållandet mellan dessa två tumörenheter har varit en debattfråga i många år. Vi tror att resultaten från vår studie bidrar till en bättre förståelse av dessa enheter, vilket visar att dessa tumörer har ett stort antal vanliga genetiska förändringar. Förutom kända TERT- promotor och TP53- mutationer identifierades förändringar i CDKN2A , FAT1 , NOTCH1 och NOTCH2 särskilt ofta.

Den omfattande skärmen för kända cancermutationer i 341 kända cancergener visade totalt sett en mycket hög frekvens av mutationer. Ett urval av dessa gener visas i figur 1 (endast gener muterade i minst tre tumörer ingår). Återkommande genmutationer kända för att aktivera signalvägar såsom MAPK-vägen identifierades inte. Inte heller var återkommande hot-spot-mutationer i andra gener än TERT- promotorn. 18 Det som var slående är att i det stora utbudet av ofta muterade gener muterades en del gener i en hög procentandel av prover, inklusive frekventa förlust av funktionsmutationer.

TERT- promotormutationer, som ursprungligen identifierades i kutan melanom 36, 37 identifierades därefter i ett brett spektrum av cancer 38 och tidigare visats av vår grupp att uppträda i majoriteten (> 70%) av atypiskt fibroxantom och pleomorf dermal sarkomprov. 18 Denna konstatering validerades i den aktuella studien (figur 1 och 2).

TP53 har varit känt för att förändras i atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom i mer än två decennier. 14, 15 Vår studie validerar denna upptäckt, visar TP53- mutationer i majoriteten av alla tumörprover (atypiskt fibroxantom MSK-IMPACT nästa generations sekvensering = 100%, atypisk fibroxantomamplikon nästa generations sekvensering = 89%, och pleomorf dermal sarkom amplikon nästa generation -generationssekvensering = 86%) med ett betydande antal prover med inaktiveringsmutationer (atypisk fibroxantom MSK-IMPACT nästa generations sekvensering = 77%, atypisk fibroxantomamplikon nästa generations sekvensering = 36%, och pleomorf dermal sarkom amplikon nästa generations sekvensering = 31%). Dessutom inträffade förluster av TP53 -genlokuset på 17p. Dessa fynd validerar TP53 som en mycket förändrad och viktig gen vid atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom.

FAT1- mutationer identifierades tidigare i olika cancerformer, inklusive glioblastom, kolorektal och huvud- och nackcancer. Både förluster och mutationer rapporterades. 39 I våra data, båda ofta förluster av Chr. 4q (figur 3) såväl som en mycket hög frekvens av genmutationer detekterades. I alla utförda skärmar var mutationsfrekvensen ~ 60% av tumörer (atypisk fibroxantom MSK-IMPACT nästa generations sekvensering = 62%, atypisk fibroxantomampikon nästa generations sekvensering = 58%, och pleomorf dermal sarkom amplikon nästa generations sekvensering = 67 %), andelen inaktiverande FAT1- mutationer> 40% (atypisk fibroxantom påverkar nästa generations sekvensering = 64%, atypisk fibroxantomampikon nästa generations sekvensering = 42%, och pleomorf dermal sarkom amplikon nästa generations sekvensering = 44%). FAT1- inaktivering har förknippats med ökad ß- katenin och Wnt-signalering, 39 antyder att Wnt-signalering kan spela en viktig roll vid atypisk fibroxantom och pleomorfisk dermal sarkompatogenes.

NOTCH- signalering, som har en kritisk roll i vävnadsutveckling, har länge varit känd för att ha en relevant roll i cancerpatogenesen. 40, 41, 42 Ursprungligen förknippade med aktivering av genetiska förändringar i hematologiska maligniteter har 43 återkommande förlust av funktionsförlust också identifierats i ett brett spektrum av maligniteter, inklusive huvud och nacke och kutan skivepitelcancer. 40, 44, 45, 46 Mycket lik kutan skivepitelcancer, vi identifierade den högsta frekvensen av mutationer i NOTCH1 (atypisk fibroxantom MSK-IMPACT nästa generations sekvensering = 85%, atypisk fibroxantom amplikon nästa generations sekvensering = 54%, och pleomorf dermal sarkom amplikon nästa generations sekvensering = 66%) följt av NOTCH2 (atypisk fibroxantom MSK-IMPACT nästa generations sekvensering = 62%, atypisk fibroxantom amplikon nästa generations sekvensering = 42%, och pleomorf dermal sarkom amplikon nästa generations sekvensering = 42% 49%). Båda generna visade också en betydande mängd inaktiverande mutationer (figur 1 och 2). Kromosomala förluster av gen loci ( NOTCH1 9q och NOTCH2 1p) var sällsynta och är förmodligen inte av betydande betydelse.

CDKN2A , som kodar för p14 och p16, är en av de mest förlorade tumörsuppressorerna hos humana neoplasier 47 och är uppenbarligen också av betydelse för atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom. Inte bara hittades den muterad i ungefär hälften av proverna i den atypiska fibroxantompåverkan nästa generations sekvenseringsskärm (6 av 13 = 46%), utan kopianalysanalys (jämförande genomisk hybridisering) visade också loket på Chr. 9p förloras i ungefär hälften av atypiskt fibroxantom och pleomorf dermal sarkom tumörprover (figur 3). Den låga mutationsgraden som detekteras i amplikon nästa generations sekvenseringsskärm beror troligen på dålig täckning av genen i vår sekvenseringspanel (tabell 1), och förlusterna av genlokuset är oftare än fokala genmutationer.

Analysen av C> T (G> A) och CC> TT (GG> AA) -mutationer associerade med UV-exponering i TP53- genen visade att dessa var ofta både i atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom, vilket representerar mer än hälften av de identifierade förändringarna i båda tumörenheter (57% i atypiskt fibroxantom och 64% i pleomorf dermal sarkom). Intressant nog upptäckte C> T (G> A) förändringar oftare i pleomorf dermal sarkom än atypisk fibroxantom (57% respektive 43% av mutationer), men CC> TT (GG> AA) var mer frekvent vid atypisk fibroxantom än pleomorf dermal sarkom (14% respektive 7% av mutationer). Medan C> T-förändringar ofta är UV-inducerade är föreningen med UV-exponering inte lika stark som är fallet för CC> TT-förändringar, som anses vara praktiskt taget patognomoniska för UV-exponering. 33, 48 Den totala höga frekvensen för dessa mutationer (både C> T och CC> TT) i både atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom stödjer klart UV-exponering som är en relevant patogen händelse i båda dessa tumörenheter.

Inga samband mellan mutationsstatus och diagnos av atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom observerades. De sällsynta föreningarna identifierades i vår studie med enskilda klinikopatologiska parametrar: ålder med NOTCH2- mutationsstatus ( P = 0, 05); tumördjup och TP53 ( P = 0, 05) mutationsstatus; och nekros och TERT- promotormutationsstatus ( P = 0, 002; kompletterande tabell 4) kommer att behöva valideras i större oberoende kohorter.

Förändringar i många gener inklusive sådana som återkommande upptäcks i atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom ( TP53 , CDKN2A , FAT1 , NOTCH1 / 2 och TERT- promotorn) har rapporterats av olika grupper i kutan skivepitelcancer. 32, 49, 50 Med tanke på att dessa tumörer (kutan squamous cellkarcinom, atypiskt fibroxantom och pleomorf dermal sarkom) alla uppstår i områden med hög soleksponering, är det troligt att likheterna i mutationsprofiler delvis beror på en vanlig UV- inducerad patogenes av dessa enheter. Signaleringsvägarna som är nödvändiga för tumörutveckling i dessa tumörer kan också vara liknande. Även om detta är en spännande hypotes, kommer ytterligare genetiska och funktionella studier att krävas för att helt avslöja likheter och skillnader i patogenesen för dessa tumörer.

Ett av målen med vår studie var att försöka identifiera genetiska skillnader som skiljer atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom. Vår studie hittar lite bevis för genetiska skillnader mellan dessa enheter. Kopieringsnummerprofilerna som bestämts här i en relativt stor grupp av tumörer (atypisk fibroxantom = 20 och pleomorfisk dermal sarkom = 22) är mycket lika, vilket tillåter ingen uppenbar separering av dessa enheter. Genetiskt innehöll båda tumörgrupper liknande frekvenser av FAT1 , TP53 , CDKN2A , TERT- promotor och NOTCH- förändringar. Det som är intressant är att aktivering av RAS- mutationer, som tidigare identifierats vara närvarande i pleomorfisk dermal sarkom (diagnostiserad då som MFH) men inte atypisk fibroxantom, också befanns distribueras på liknande sätt i vår kohort. Dessa aktiverande mutationer (2 HRAS G12S, G13V och 1 KRAS G12D) var emellertid sällsynta, närvarande endast i 3 av 35 (9%) pleomorf dermal sarkom. Som sådan verkar det osannolikt att bestämma RAS- mutationsstatus kommer att vara användbar vid klinisk distinktion mellan atypiskt fibroxantom och pleomorf dermal sarkom.

Med tanke på de höga mutationsfrekvenserna och förändringarna av kopienummer som finns i både atypiskt fibroxantom och pleomorf dermal sarkom, tyder vår studie på att det kommer att förbli svårt att fullt ut förstå de viktiga genetiska mekanismerna som är involverade i utvecklingen av dessa tumörer. Hela exome- eller helgenom-sekvensering kan ge mer insikt, men att särskilja relevanta förarmutationer från det åtföljande mycket höga antalet passagerarmutationer kan visa sig vara en betydande utmaning. I vilken utsträckning förändringar kan identifieras, vilket gör att en tydlig åtskillnad av atypisk fibroxantom och pleomorf dermal sarkom kvarstår.

As most mutations identified in our screen are assumed to be loss-of-function mutations, it may prove difficult identifying effective treatment strategies targeting cell intrinsic signaling pathways in atypical fibroxanthoma or pleomorphic dermal sarcoma. On the other hand, given that high mutational load is associated with better responses to immunotherapy with anti-CTLA4 and anti-PD1 immune checkpoint blockade therapies in many different cancer entities, 51, 52, 53, 54 our findings may suggest immunotherapy as a promising therapeutic approach for recurrent or metastatic pleomorphic dermal sarcoma.

Weaknesses of our study are that only a selection of genes were analyzed. Whole-exome or whole-genome approaches should prove valuable in the future, however considering the high mutation frequency we observed, large numbers of tumors will need to be assessed to identify relevant recurrent events. Obtaining the necessary number of tissue samples (preferably fresh-frozen with paired germline DNA) and performing a meaningful bioinformatics analysis may prove challenging. The lack of available paired normal tissue in our study is another considerable caveat. Although most germline variants will have been successfully excluded by cross-referencing SNP databases, we cannot exclude the possibility that occasional germline variants were interpreted as somatic mutations. As a result, the frequency of somatic mutations we report is likely to be somewhat higher than is actually the case. However, the comparable results obtained in our study through two separate NGS approaches, capture (MSK-IMPACT NGS) and amplicon (amplicon NGS) and analyzed by two different bioinformatics approaches, supports the validity and accuracy of the somatic mutation profiles we report. However, larger future studies with paired germline DNA will be valuable to validate our findings and further elucidate the genetic landscape of these tumor entities.

Despite certain shortcomings, our study is the most comprehensive to date identifying both a number of previously unrecognized recurrent gene mutations (ie, NOTCH1, NOTCH2 , and FAT1 ) and a fairly comprehensive picture of copy number alterations in these tumors. Our findings do not fully resolve the long-standing debate as to the relationship between atypical fibroxanthoma and pleomorphic dermal sarcoma. However, we do believe the similar gene mutations and copy number profiles identified argue strongly the tumors are related, potentially representing entities along a common tumor spectrum. Whereas future studies may manage to identify robust genetic or other biomarkers allowing a clear diagnostic distinction of these two tumor entities, our current findings suggest the established histological criteria for distinguishing these two entities (eg, larger tumor size with extensive involvement of the subcutis, musculature or fascia, perineural or perivascular invasion, or tissue necrosis) will remain of paramount importance in determining the prognosis and correct clinical management of affected patients.

In summary, our data demonstrate that atypical fibroxanthoma and pleomorphic dermal sarcoma harbor a large number of genetic alterations, including frequent TP53 , CDKN2A , TERT promoter, NOTCH1 and NOTCH2 , and FAT1 gene alterations, and a wide range of copy number alterations. Rare activating RAS mutations were only present in pleomorphic dermal sarcoma (9% of tumors). Whereas we believe these findings offer valuable insights into the pathogenesis of these tumors, it remains to be shown if they will be of diagnostic or therapeutic value in a clinical setting.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Supplementary Table 1

  2. 2.

    Supplementary Table 4

Excel-filer

  1. 1.

    Supplementary Table 2

  2. 2.

    Supplementary Table 3

    Supplementary Information accompanies the paper on Modern Pathology website (//www.nature.com/modpathol)