Förening av lymfkörtelantigener med lägre gagspecifikt centralt minne och högre env-specifika effektorminne cd8 + t-cellfrekvenser i en makakhjälpmodell | vetenskapliga rapporter

Förening av lymfkörtelantigener med lägre gagspecifikt centralt minne och högre env-specifika effektorminne cd8 + t-cellfrekvenser i en makakhjälpmodell | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • HIV-infektioner
  • Viralt värdsvar
  • Viral immundundation

Abstrakt

Virusspecifika CD8 + T-celler utövar starkt undertryckande tryck på human / simian immunbristvirus (HIV / SIV) replikation. Dessa svar har undersökts intensivt i perifera mononukleära blodceller (PBMC) men har inte analyserats fullständigt i lymfkörtlar (LN), där interaktion mellan CD8 + T-celler och HIV / SIV-infekterade celler förekommer. Här undersökte vi målantigenspecificitet för CD8 + T-celler i LN i en makak AIDS-modell. Analys av virusantigenspecifikt CD8 + T-cellsvar i de inguinala LN: er erhållna från tjugo rhesusmakaker i den kroniska fasen av SIV-infektion visade en omvänd korrelation mellan virala belastningar och frekvenser av CD8 + T-celler med CD28 + CD95 + centralt minne fenotyp inriktning på den N-terminala halvan av SIV-kärnantigen (Gag-N). Däremot avslöjade analys av LN: er men inte PBMC: er en positiv korrelation mellan virala belastningar och frekvenser av CD8 + T-celler med CD28 - CD95 + effektorminnefenotyp riktad mot den N-terminala halvan av SIV-höljet (Env-N), lösligt antigen. I själva verket uppvisade LN: er med detekterbart SIV-kapsid p27-antigen i kärncentret signifikant lägre Gag-N-specifika CD28 + CD95 + CD8 + T-cell och högre Env-N-specifika CD28 - CD95 + CD8 + T-cell-svar än de utan detekterbar p27. Dessa resultat antyder att kärn- och höljesantigen-specifika CD8 + T-celler visar olika interaktionsmönster med HIV / SIV-infekterade celler.

Introduktion

CD8 + T-cellresponser riktade mot variationer av virala antigener induceras efter infektion av humant immunbristvirus (HIV). Dessa CD8 + T-celler spelar en central roll i upplösningen från akutfasviremi 1, 2, 3, 4 men tillåter mestadels bestående HIV-replikering, vilket leder till AIDS-progression. Högfrekventa CD8 + T-celler som observerats i den kroniska fasen av HIV-infektion räcker inte för viruskontroll 5, 6, 7, och högeffektiva CD8 + T-celler anses viktiga för att förebygga sjukdomens progression. Flera humana leukocytantigen (HLA) eller huvudhistokompatibilitetskomplex klass I (MHC-I) -alleler är kända för att vara associerade med effektiva CD8 + T-celleresponser och lägre virala belastningar vid HIV-infektion 8, 9, 10, 11 . Dessutom har tidigare vaccinförsök i makak AIDS-modeller visat möjlig minskning av virala belastningar efter utmaning genom induktion av effektiva CD8 + T-cell-svar 12, 13, 14, 15 . Dessa antyder att HIV-replikering kan kontrolleras av potenta CD8 + T-cell-svar 16 .

Individuella virala proteiner visar olika kinetik för uttryck och nedbrytning, vilket kan påverka effektiviteten av protein-härledd epitoppresentation till CD8 + T-celler. Således kan vissa virala proteiner vara målen för effektiva CD8 + T-celler ofta, men andra inte. Analys av HIV-kontroller som har skyddande HLA-klass I-alleler, såsom HLA-B * 27 och HLA-B * 57, fann potenta CD8 + T-cell-svar riktade till HIV-kärn-Gag-epitoper (såsom HLA-B * 27-begränsade Gag 263–272 KK10 och HLA-B * 57-begränsad Gag 240–249 TW10) bidrar till HIV-kontroll 17, 18, 19 . Studier i makak AIDS-modeller har visat kontroll av simian immunbristvirus (SIV) genom Gag-antigen-specifika CD8 + T-cell-svar 12, 20, 21 . Förutom dessa studier på HIV / SIV-kontroller, visade analys i en stor kohort av HIV-infekterade individer att Gag-specifika CD8 + T-cell-svar är associerade med lägre virala belastningar 22, 23, 24 .

Förståelse av målproteinprofilerna för effektiva CD8 + T-celler är viktiga i utvecklingen av en interventionsstrategi mot HIV-1-kontroll. Virusspecifika CD8 + T-cellerespons har undersökts intensivt i perifert blod men inte fullständigt analyserats i lymfkörtlar (LNs) där interaktion mellan CD8 + T-celler och virusinfekterade celler förekommer, även om flera studier undersökte dem i LNs (ref 25) och 26). I den aktuella studien undersökte vi målantigenprofiler av LN-härledda CD8 + T-celler i den kroniska fasen av SIV-infektion i rhesusmakaker. Vår analys indikerade att virala belastningar var korrelerade omvänt med SIV-kärn-Gag-antigen-specifikt centralt minne men positivt med SIV-kuvert (Env)-antigen-specifikt effektor-minne CD8 + T-cell-frekvenser i LN.

Resultat

CD8 + T-cell-svar riktade mot enskilda SIV-antigener i LN: er

Vi undersökte SIV-antigen-specifika CD8 + T-cell-svar i inguinala LN: er och PBMC erhållna från tjugo rhesus-makaker i den kroniska fasen av SIV-infektion (fig. 1). Vi använde djur med variationer av MHC-I-haplotyper eftersom MHC-I-genotyper är associerade med målantigener för CD8 + T-celler. De tjugo makakerna bestod av tretton ovaccinerade inklusive både icke-kontrollörer och kontrollörer och sju vaccinerade, inklusive både icke-kontrollörer och kontroller.

( a ) Lista över tjugo makaker som används i denna studie. Bestämda MHC-I-haplotyper i enskilda djur visas. Tretton djur vaccinerades. MHC-I-haplotyp A + djur # 14, # 15 och # 16 fick ett DNA-prime / SeV-boost-vaccin som framkallar Gag 241–249- specifika CD8 + T-cell-svar. Ett + djur nr 17 fick ett DNA-prime / SeV-boost framkalla Gag 206-216- specifika CD8 + T-cell-svar. Djuren # 18, # 19 och # 20 fick ett DNA-prime / SeV-Gag-boost. Djur nr 18 utmanades med en SIV som bär fem gagmutationer 20, medan alla andra djur infekterades med vildtypen SIVmac239. Plasmavirusbelastningar vid eutanasi (vid angivna månader efter infektion [pi]) visas. Virala belastningar i makaker # 4, # 5 och # 11 beskrevs tidigare 38, 41 . Resultat på immunohistokemianalys för att detektera SIV p27-antigen i inguinala LN erhållna vid eutanasi visas också. ND, inte bestämd. ( b ) SIV individuella antigenspecifika CD8 + T-cell-svar i de tjugo makakerna vid eutanasi. Frekvenser av CD8 + T-celler (% av CD8 + T-celler) som är inriktade på Gag-N, Gag-C, Pol-N, Pol-C, Vif, Vpx, Vpr, Env-N, Env-C, Tat, Rev och Nef i de inguinala LN: erna (övre panelen) och PBMC: er (nedre panelen) visas.

Bild i full storlek

Alla makaker visade detekterbara SIV Nef-antigen-specifika CD8 + T-cell-svar i LN: erna. CD8 + T-cell-svar riktade mot den N-terminala halvan av SIV Gag (Gag-N), SIV Vif och den N-terminala halvan av SIV Env (Env-N) antigen detekterades hos sjutton eller arton djur, medan svar specifika för andra SIV-antigener var detekterbara i mindre djur.

Korrelationsanalyser (fig. 2) visade ingen samband mellan plasmavirusbelastningar och hela SIV-antigen-specifika CD8 + T-cellfrekvenser (summan av Gag-N-, Gag-C-, Pol-N-, Pol-C-, Vif-, Vpx-, Vpr-, Env-N-, Env-C-, Tat-, Rev- och Nef-specifika CD8 + T-cellfrekvenser) i LN: erna i den kroniska fasen. Men vi hittade en omvänd korrelation mellan virala belastningar och Gag-N-specifika CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0072, r = −0, 5813 genom Spearmans test). Däremot korrelerades Env-N-specifika CD8 + T-cellfrekvenser positivt med virala belastningar ( p = 0, 0102, r = 0, 5602). Ingen signifikant korrelation observerades mellan virala belastningar och frekvenser av CD8 + T-celler riktade mot andra SIV-antigen i LN.

Korrelation analyserades mellan virala belastningar och frekvenser av CD8 + T-celler riktade mot Gag-N, Gag-C, Pol-N, Pol-C, Vif, Vpx, Vpr, Env-N, Env-C, Tat, Rev, Nef, eller hela SIV-antigen i inguinala LN: er i den kroniska fasen av SIV-infektion. Virala belastningar var omvänt korrelerade med Gag-N-specifika CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0072, r = 0, 5813 genom Spearmans test) och korrelerade positivt med Env-N-specifika CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0102, r = 0, 5602), som visas i de två översta panelerna.

Bild i full storlek

Vi undersökte också SIV-antigen-specifika CD8 + T-cell-svar i perifera mononukleära blodceller (PBMC) hos dessa djur (fig. 3). Vi bekräftade en omvänd korrelation mellan virala belastningar och Gag-N-specifika CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0079, r = −0, 5755), men ingen signifikant korrelation observerades mellan virala belastningar och Env-N-specifik CD8 + T- cellfrekvenser i PBMC: er. Dessutom korrelerades virala belastningar omvänt med Vif- och Nef-specifika CD8 + T-cellfrekvenser i PBMC: er (Vif: p = 0, 0067, r = −0, 5855; Nef: p = 0, 0145, r = −0, 5376). En omvänd korrelation observerades också mellan virala belastningar och hela SIV-antigen-specifika CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0442, r = −0, 4544), vilket kan återspegla ovanstående omvända korrelationer mellan virala belastningar och Gag-N / Vif / Nef- specifika CD8 + T-cellfrekvenser i PBMC: er.

Korrelation analyserades mellan virala belastningar och frekvenser av CD8 + T-celler riktade mot Gag-N, Gag-C, Pol-N, Pol-C, Vif, Vpx, Vpr, Env-N, Env-C, Tat, Rev, Nef, eller hela SIV-antigen i PBMC i den kroniska fasen av SIV-infektion. Virala belastningar var omvänt korrelerade med Gag-N-, Vif- och Nef-specifika CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0079, r = −0, 5755 på Gag-N; p = 0, 0067, r = −0, 5855 på Vif ; p = 0, 0145, r = -0, 5376 på Nef genom Spearmans test). En marginell invers korrelation observerades också mellan virala belastningar och hela SIV-antigen-specifika CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0442, r = −0, 4544). Ingen signifikant korrelation observerades mellan virala belastningar och Env-N-specifika CD8 + T-cellfrekvenser.

Bild i full storlek

Centralminne- och effektorminnesuppsättningar av SIV-antigen-specifika CD8 + T-celler i LN: er

För att se basen för observationerna ovan undersökte vi frekvenser av CD28 + CD95 + (centralt minne) och CD28 - CD95 + (effektorminne) undergrupper av SIV-antigen-specifika CD8 + T-celler i LN: erna (Fig. S1a, som visar en representativt grindningsschema för flödescytometrisk analys). I LN: er var majoriteten av SIV-antigenspecifika CD8 + T-celler CD28 + CD95 + . Emellertid observerades CD28 - CD95 + underuppsättningar i Env-N-specifika CD8 + T-celler ofta. En positiv korrelation mellan virala belastningar och CD28 - CD95 + delmängdsfrekvenser i hela SIV-antigen-specifika CD8 + T-celler observerades ( p = 0, 0449, r = 0, 4530 med Spearmans test) (Fig. S1b). Vi undersökte också frekvenser av CD28 + CD95 + och CD28 - CD95 + underuppsättningar av SIV-antigenspecifika CD8 + T-celler i PBMC: er, men ingen signifikant korrelation observerades mellan virala belastningar och CD28 - CD95 + delmängdsfrekvenser i hela SIV-antigen-specifika CD8 + T-celler i PBMC: er (fig. S1b).

Korrelationsanalyser visade en omvänd korrelation mellan plasmavirusbelastningar och Gag-N-specifik CD28 + CD95 + (centralt minne) CD8 + T-cellfrekvenser i LN: erna ( p = 0, 0042, r = 0, 6115) (Fig. 4a). Ingen signifikant korrelation observerades mellan virala belastningar och Gag-N-specifik CD28 - CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser. Däremot fann vi en stark positiv korrelation mellan virala belastningar och Env-N-specifik CD28 - CD95 + (effektorminne) CD8 + T-cellfrekvenser i LN: erna ( p = 0.0009, r = 0.6833), medan ingen korrelation observerades mellan virala belastningar och Env-N-specifik CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser (fig. 4a). Dessutom korrelerades virala belastningar omvänt med Vif-specifika CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0257, r = -0, 4972) (Fig. S2). Ingen signifikant korrelation observerades mellan virala belastningar och frekvenser av CD28 - CD95 + eller CD28 + CD95 + CD8 + T-celler riktade mot andra SIV-antigener.

( a ) Korrelationsanalyser mellan virala belastningar och Gag-N- eller Env-N-specifik CD28 - eller CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser i inguinala LN: er. Virala belastningar var omvänt korrelerade med Gag-N-specifik CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0042, r = −0, 6115 med Spearmans test) och korrelerade positivt med Env-N-specifika CD28 - CD95 + CD8 + T -cellfrekvenser ( p = 0, 0009, r = 0, 6833). ( b ) Korrelationsanalyser mellan virala belastningar och Gag-N- eller Env-N-specifik CD28 - eller CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser i PBMC. Virala belastningar korrelerades omvänt med Gag-N-specifik CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0026, r = 0, 6356 med Spearmans test). Ingen signifikant korrelation observerades mellan virala belastningar och Env-N-specifik CD28 - CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser.

Bild i full storlek

Virala belastningar korrelerades också omvänt med Gag-N-specifik CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser i PBMC: er ( p = 0, 0026, r = 0, 6356) (fig. 4b). Det är anmärkningsvärt att ingen korrelation observerades mellan virala belastningar och Env-N-specifik CD28 - CD95 + eller CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser i PBMC: er (fig. 4b). Vidare korrelerades virala belastningar omvänt med Vif- och Nef-specifika CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser i PBMC: er (Vif: p = 0, 0315, r = −0.4818; Nef: p = 0.0343, r = −0.4750 ) (Fig. S3). En omvänd korrelation observerades också mellan virala belastningar och hela SIV-antigenspecifika CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0097, r = 0, 5632).

Ovanstående analyser utfördes med användning av tjugo SIV-infekterade djur bestående av tretton unvaccinerade och sju vaccinerade. Vi undersökte sedan om ovanstående resultat kan bekräftas genom att endast använda de tidigare ovaccinerade djuren. I analyserna med användning av tretton ovaccinerade djur korrelerades plasmavirusbelastningar omvänt med Gag-N-specifik CD28 + CD95 + (centralt minne) CD8 + T-cellfrekvenser ( p = 0, 0329, r = −0, 5810) och korrelerade positivt med Env- N-specifik CD28 - CD95 + (effektorminne) CD8 + T-cellfrekvenser i LN: er ( p = 0, 0112, r = 0, 66964) (Fig. S4). Ingen signifikant korrelation observerades mellan virala belastningar och frekvenser för Gag-N-specifik CD28 - CD95 + CD8 + T-celler eller Env-N-specifik CD28 + CD95 + CD8 + T-celler. Dessa överensstämmer med resultaten erhållna från de tjugo makaker som visas i fig. 4a.

Slutligen undersökte vi SIV Gag-kapsid p27-antigen i LN: erna härledda från sexton djur genom immunfärgning. I nio av dem detekterades p27 tydligt i kärncentrum men inte i det parakortiska området (fig. 5a). Antigenet var detekterbart i de flesta av djuren med mer än 1, 0 x 104 kopior / ml plasmavirusbelastningar med undantag för djur nr 1, men omöjligt att upptäcka hos de med mindre än 1, 0 x 104 kopior / ml förutom djur # 7 (Fig 1a). Jämförelse av T-cell-svar visade signifikant högre Gag-N-specifika CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser i LN: erna utan detekterbara p27 än de med detekterbara p27 ( p = 0, 0323 av Mann-Whitney U-test) (Fig. 5b). Däremot var Env-N-specifik CD28 - CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser signifikant högre i LN: erna med detekterbara p27 ( p = 0, 0086) (fig. 5b). Gag-N-specifika CD28 + CD95 + CD8 + T-celler var faktiskt positiva i alla LN utan detekterbara p27, medan Env-N-specifika CD28 - CD95 + CD8 + T-celler var positiva i alla p27-positiva LN: er men negativa i sex av de sju p27-negativa LN: erna.

( a ) Immunostaining genom anti-p27 antikropp. Representativa resultat p27-positivt (vänster panel) och p27-negativt (höger panel) visas. I den vänstra panelen detekterades p27 i kärncentret. ( b ) Jämförelser av Gag-N-specifik CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser (vänster panel) och Env-N-specifik CD28 - CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser (höger panel) i p27-positiva (n = 9) och p27-negativa (n = 7) LN. LN: er med detekterbar p27 hade signifikant lägre Gag-N-specifik CD28 + CD95 + CD8 + T-cell ( p = 0, 0323 med Mann-Whitney U-test) och signifikant högre Env-N-specifik CD28 - CD95 + CD8 + T-cell frekvenser ( p = 0, 0086) än de utan detekterbara p27.

Bild i full storlek

Diskussion

Kumulativa studier har visat starkt undertryckande tryck på HIV-1-replikation med Gag-specifika CD8 + T-celler 9, 27, 28, 29, 30 . Ett omvänt samband mellan plasmavirusbelastningar och Gag-specifika CD8 + T-cell-svar i PBMC visades tidigare av en stor kohort av HIV-1-infekterade individer 22, 23, 24 . Föreliggande studie fann att virala belastningar var omvänt korrelerade med Gag-N-specifika CD8 + T-cellfrekvenser även i de inguinala LN: erna i en makak AIDS-modell. Ytterligare analys indikerade att detta är baserat på en omvänd korrelation mellan virala belastningar och Gag-N-specifikt centralt minne CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser i LN: er. Dessa resultat stöder starkt en uppfattning att CD8 + T-celler som är inriktade på den N-terminala halvan av Gag-antigen inklusive det mesta av den N-terminala domänen av kapsid (CA) (refs 31 och 32) utövar starkt undertryckande tryck på SIV-replikering i LN. CD8 + T-cellsvar som är inriktade på mer lokaliserade regioner i Gag-N kan vara mer starkt associerade med lägre virala belastningar. LN utan detekterbara p27 hade signifikant högre frekvens Gag-N-specifik CD28 + CD95 + CD8 + T-celler än de med detekterbara p27. I de senare LN: erna med detekterbar p27 kan Gag-N-specifik CD28 - CD95 + CD8 + T-celler, även om de induceras, konsumeras för att slåss mot SIV-infekterade celler.

Analys av LN: er avslöjade en positiv korrelation mellan virala belastningar i plasma och Env-N-specifika CD8 + T-cellfrekvenser. Det är anmärkningsvärt att frekvenser för det Env-N-specifika effektorminnet CD28 - CD95 + delmängd i CD8 + T-celler i LN: er korrelerade med virala belastningar. Denna korrelation hittades genom analys av LN men bekräftades inte i PBMC. LN med detekterbara p27 hade signifikant högre frekvens Env-N-specifika CD28 - CD95 + CD8 + T-celler än de utan detekterbara p27. Faktiskt var Env-N-specifika CD28 - CD95 + CD8 + T-celler positiva i alla p27-positiva LN: er men negativa i de flesta av de p27-negativa LN: erna. Dessa resultat indikerar att Env-N-specifik CD28 - CD95 + CD8 + T-cell-svar återspeglar SIV-replikering i LN: er. Detta antyder en möjlighet att SIV-replikering resulterar i induktion av Env-N-specifika CD8 + T-celleffektorer, som inte utövar effektorfunktion för att undertrycka viral replikation och förbli i LN: er.

Föreliggande studie indikerar att induktion av Env-N-specifika CD8 + T-celler i LN inte bidrar till undertryckande av SIV-replikation. Vi fann associering av virala belastningar med CD8 + T-celler som är inriktade på den N-terminala halvan av Env inklusive det mesta av Env-ytprotein (SU, gp120) men inte med de som är inriktade på den C-terminala halvan av Env inklusive Env-transmembranprotein (TM, gp41) ). Anti-SIV-antikroppar riktar sig ofta mot den tidigare Env-N-regionen, vilket resulterar i dess större mångfald 33, 34 En möjlig förklaring är således att hög mångfald av Env-N-kodande regioner i viralt genom kan resultera i ineffektivt igenkänning och dödande av mål-SIV-infekterade celler med Env-N-specifika CD8 + T-celler.

Vårt immunfärgning upptäckte SIV p27-antigen i det germinala centrum av inguinala LN: er. SIV-infekterade CD4 + T-celler i kärncentret kan ha mindre chans att möta SIV-specifika CD8 + T-celler jämfört med de i det parakortiska området 35 . Sedan kan det spekuleras att SIV-replikering i det kärncentrum som producerar lösliga gpl20-antigener, vilket resulterar i induktion av Env-N-specifika CD8 + T-celler i det parakortiska området. Detta kan också förklara sambandet mellan Env-N-specifika CD8 + T-cell-svar med SIV-replikering i LN: er.

Sammanfattningsvis hittade vi en omvänd korrelation mellan plasmavirusbelastningar och Gag-N-specifikt centralt minne CD28 + CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser. Vidare avslöjade analys av LN: er en positiv korrelation mellan virala belastningar och Env-N-specifikt effektorminne CD28 - CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser i den kroniska fasen av SIV-infektion. LN: er med detekterbart p27-antigen hade lägre Gag-N-specifika CD28 + CD95 + CD8 + T-cell och högre Env-N-specifika CD28 - CD95 + CD8 + T-cellfrekvenser än de utan detekterbara p27. Dessa resultat antyder att kärn- och höljesantigen-specifika CD8 + T-celler uppvisar olika interaktionsmönster med HIV / SIV-infekterade celler.

metoder

Djurförsök

Vi använde tjugo burmesiska rhesusmakaker ( Macaca mulatta ) kroniskt infekterade med SIV (fig. 1a) för den aktuella studien. Sjutton makaker av de tjugo hade använts i våra tidigare SIV-utmaningsexperiment 20, 36, 37, 38, 39, 40, 41 . Djur med variationer av MHC-I-haplotyper inklusive en skyddande MHC-I-haplotyp, 90-010-Id (D) (ref. 39), användes i denna studie. Bestämningen av makak MHC-I-haplotyper baserades på familjestudien i kombination med den referenssträngmedierade konformationsanalysen av Mamu-A- och Mamu-B- gener och detektion av stora Mamu-A- och Mamu-B- alleler genom kloning av omvänd transkription. (RT) -PCR-produkter som beskrivits tidigare 42, 43 . Bekräftade MHC-I-alleler bestående av MHC-I-haplotyper 90-120-Ia (A), 90-120-Ib (B), D, 90-010-Ie (E), 90-030-Ih (H) och 89-002-Iq (Q) beskrevs före 38, 43 .

Av de tjugo makakerna var tretton unvaccinerade och sju vaccinerade. Av de senare sju fick tre makaker med MHC-I-haplotyp A, som är förknippade med dominerande SIV Gag 206–216 - och Gag 241–249- specifika CD8 + T-cell-svar 20, 38, en DNA-prime följt av en intranasal boost med ett Sendai-virus (SeV) -vektor som framkallar Gag 241–249- specifika CD8 + T-cellsvar och en A-positiv makak fick ett DNA-prime / SeV-boost-vaccin som framkallar Gag 206–216- specifik CD8 + T- cellsvar som beskrivits tidigare 36, 37 . De återstående tre fick en DNA-prim följt av ett boost med en SeV-vektor som uttrycker SIVmac239 Gag (SeV-Gag) (ref. 20, 40). Efter vaccination utmanades en DNA / SeV-Gag-vaccinerad makak intravenöst med en SIV som bär fem gagmutationer vilket resulterar i en L-till-S-substitution vid den 216: e aminosyran i Gag, en D-till-E vid 244: e, en I-till-L vid 247: e, en A-till-V vid den 312: e och en A-till-T vid den 373: e (ref. 20), medan alla andra djur utmanades intravenöst med vildtypen SIVmac239.

Djurförsök genomfördes i Institute for Virus Research, Kyoto University (IVRKU) och National Institute of Biomedical Innovation (NIBP; för närvarande byttes namn på National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition [NIBIOHN]) med hjälp av Corporation for Production and Forskning av laboratorieprater efter godkännande av utskottet för etik för djurförsök med IVRKU och NIBP enligt riktlinjen för djurförsök vid IVRKU, NIBP och National Institute of Infectious Diseases, som är i enlighet med riktlinjerna för korrekt genomförande av djurförsök inrättat av Science Council of Japan (//www.scj.go.jp/ja/info/kohyo/pdf/kohyo-20-k16-2e.pdf). Blodinsamling, vaccination och SIV-utmaning utfördes under ketaminanestesi. Djur avlivades i slutet av experimenten eller vid slutpunkten bestämdes genom reduktion i 10% förlust av kroppsvikt, diarré och allmän svaghet. Djur med mindre än 200 celler / μl perifert CD4 + T-cellantal inkluderades inte i denna studie. Vid eutanasi bedövades djuren djupt med pentobarbital under ketaminanestesi och sedan samlades fullblod från vänster kammare. De inguinala LN: erna erhölls vid obduktion strax efter avlivningen.

Analys av antigenspecifika CD8 + T-cellsvar

Vi mätte antigen-specifik CD8 + T-cell-svar genom flödescytometrisk analys som detekterade gamma-interferon (IFN-y) induktion efter specifik stimulering såsom beskrivits tidigare 40 . PBMC: er eller lymfocyter härrörande från de inguinala LN: erna odlades med autologa herpesvirus papio-immortaliserade B-lymfoblastoidcellinjer (B-LCL) pulserade med peptidpooler (vid en slutlig koncentration av 1 till 2 μM för varje peptid) med användning av paneler med överlappande peptider som sträcker sig hela SIVmac239 Gag-N (den N-terminala halvan av Gag [1–265: e aminosyrorna]), Gag-C (den C-terminala halvan av Gag [255: e-510: e]), Pol-N (den N-terminala halvan av Pol [1st – 531st]), Pol-C (C-terminalhalvan av Pol [521st-1060th]), Vif, Vpx, Vpr, Env-N (N-terminalhalvan av Env [1st – 447th]), Env-C (den C-terminala halvan av Env [437: e-879: e]), Tat, Rev respektive Nef-aminosyrasekvenserna. Intracellulär IFN-y-färgning utfördes med ett CytofixCytoperm-kit (BD) och fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugerat anti-humant CD4 (M-T477, BD), peridininklorofyllprotein (PerCP) -konjugerat anti-humant CD8 (SK1, BD) ), allofykocyanin-Cy7 (APC-Cy7) -konjugerad anti-human CD3 (SP34-2, BD), allofykocyanin (APC) -konjugerad anti-human CD28 (CD28.2, Biolegend), phycoerythrin-Cy7 (PE-Cy7) -konjugerad anti-human CD95 (DX2, eBioscience) och phycoerythrin (PE) -konjugerad anti-human IFN-y (4S.B3, Biolegend) monoklonala antikroppar. Specifika T-cellfrekvenser beräknades genom att subtrahera icke-specifika IFN-y + T-cellfrekvenser från de efter antigenspecifik stimulering. Som negativa kontroller undersökte vi Gag-N- och Gag-C-specifika CD8 + T-cell-svar i elva naiva burmesiska rhesusmakaker. Värdet "M + 2 × SD" (där M är medelvärdet och SD är standardavvikelsen) för dessa negativa kontroller var 0, 02% (av CD8 + T-celler). Sedan ansågs specifika CD8 + T-cellfrekvenser lägre än 0, 02% av CD8 + T-celler negativa.

Detektion av viralt antigen i inguinala lymfkörtlar

Virala antigener (Gag-kapsid [CA] p27) i inguinala LN: er bestämdes genom immunohistokemi med användning av en kanin anti-SIV Gag p27 polyklonal antikropp (framställd av oss) och ett anti-kaninimmunoglobulin (EnVision / HRP, DAKO Cytomation) (ref. 44 ). Sektionerna försänkts med hematoxylin.

Statistisk analys

Alla statistiska analyser utfördes med användning av Prism-programvaruversion 4.03 (GraphPad Software, Inc.). Jämförelse av antigenspecifika CD8 + T-cellfrekvenser utfördes med Mann-Whitney U-test (signifikansnivåer inställd på P <0, 05). Korrelationsanalys utfördes med Spearmans test (signifikansnivåer inställda på P <0, 05).

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Ishii, H. et al. Förening av lymfkörtelantigener med lägre Gag-specifikt centralt minne och högre Env-specifika effektorminne CD8 + T-cellfrekvenser i en makak AIDS-modell. Sci. Rep. 6, 30153; doi: 10.1038 / srep30153 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.