Bedömning av hjärnreferensgener för rt-qpcr-studier i neurodegenerativa sjukdomar | vetenskapliga rapporter

Bedömning av hjärnreferensgener för rt-qpcr-studier i neurodegenerativa sjukdomar | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Molekylär neurovetenskap
  • Omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion
  • Transkription

Abstrakt

Utvärdering av genuttrycksnivåer genom kvantitativ realtids-PCR (RT-qPCR) med omvänd transkription har under många år varit favoritmetoden för att upptäcka sjukdomsassocierade förändringar. Normalisering av resultat till stabilt uttryckta referensgener (RG) är avgörande för att få tillförlitliga resultat. Detta är särskilt viktigt i relation till neurodegenerativa sjukdomar där sjukdomsrelaterade strukturella förändringar kan påverka de mest använda RG: erna. Vi analyserade 15 kandidat-RG: er i 98 hjärnprover från två hjärnregioner från Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Multiple System Atrophy och Progressive Supranuclear Pares patienter. Med hjälp av RefFinder, ett webbaserat verktyg för utvärdering av RG-stabilitet, identifierade vi de mest stabila RG: er UBE2D2, CYC1 och RPL13, som vi rekommenderar för framtida RT-qPCR-studier på hjärnvävnad från dessa patienter. Ingen av de undersökta generna påverkades av experimentella variabler såsom RIN, PMI eller ålder. Resultaten validerades vidare genom expressionsanalyser av en målgen GSK3B , känd för att påverkas av AD och PD. Vi erhöll höga variationer i GSK3B- nivåer när vi kontrasterade resultaten med olika uppsättningar vanliga RG som underströk vikten av en priori validering av RG för RT-qPCR-studier.

Introduktion

Omvänd transkription kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (RT-qPCR) är en av de mest använda metoderna för analys av genuttrycksnivåer på grund av dess metodiska tillgänglighet och höga känslighet. Studier av neurodegenerativa sjukdomar är inga undantag, och RT-qPCR har hjälpt till att identifiera förändringar av genuttryck och därmed sjukdomsassocierade gener i flera störningar, t.ex. Alzheimers sjukdom (AD) 1, 2, 3, 4 och Parkinsons sjukdom (PD) 5 6, 7 . Identifiering av små, dynamiska förändringar i genuttryck är viktigt för att förstå de mekanismer som ligger till grund för neurodegenerativa händelser. Ett väsentligt steg i utvecklingen av RT-qPCR-analyser är identifiering av lämpliga referensgener (RG) som ska användas som endogena kontroller vid datanormalisering. Hushållsgener (HKG) är ofta det mest uppenbara valet som konstitutiva RG eftersom HKG är viktiga för basala cellfunktioner och bör därför uppvisa stabila nivåer under normala och patofysiologiska förhållanden. Det har emellertid visats att expressionsnivåer för många HKG: er också kan påverkas av sjukdomsmedierade patologiska förändringar i t.ex. cellhomeostas och metabolism 8, 9 . Således är valet av stabila RG kritiskt för att undvika metodologiska fel. Under många år har glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas ( GAPDH ) och beta (ß) -aktin ( ACTB ) varit de primära valen som RG. Under det senaste decenniet har dock ett stort antal studier dokumenterat att dessa gener bör användas med försiktighet eftersom de kan visa variabla uttrycksnivåer över olika celltyper och sjukdomstillstånd 10, 11, 12, 13, 14 .

Beskrivande statistik är det mest enkla sättet att jämföra RG-uttrycksstabilitet. Även om det är allmänt tillämpat har denna strategi sina fallgropar på grund av dess enkelhet. Det finns flera mer avancerade metoder tillgängliga som hanterar problemet med RG-transkriptionsstabilitet med hänsyn till flera parametrar. De fyra vanligaste är ΔCt-metoden 15 och de tre algoritmerna Genorm 16, BestKeeper 17 och NormFinder 18 (granskad någon annanstans 19 ). RefFinder, en gratis online-mjukvaruplattform för identifiering av stabila RG, har en omfattande rangordning baserad på det geometriska medelvärdet för poängen från Genorm, BestKeeper, NormFinder och ΔCt-metoden för att extrahera de bästa RG: erna baserade på de olika matematiska metoderna 20 . Även om dessa metoder skiljer sig åt i deras matematiska utformning, har studier endast visat små variationer i resultaten för Genorm, NormFinder och BestKeeper, och även mellan de fristående applikationerna för Genorm, NormFinder och BestKeeper och RefFinder, vilket gör dessa metoder jämförbara 21 22

Det övergripande syftet med denna studie var att utvärdera förmodade RG: er för användning i genuttryckstudier på de mänskliga hjärnorna i olika men patologiskt besläktade neurodegenerativa sjukdomar. Här rapporterar vi om 15 kandidat-RG som potentiellt kan användas för normalisering av genuttrycksdata i hjärnprover från patienter diagnostiserade med AD, PD, Multiple System Atrophy (MSA) eller Progressive Supranuclear Palsy (PSP) jämfört med normal, icke- neurologiskt påverkade kontroller (NC). Vi valde RG-kandidater utifrån deras omfattande användning i RT-qPCR-studier från litteraturen samt deras närvaro i redo att använda kommersiella kit för RG-urval. Flera av RG-kandidaterna har tidigare undersökts under olika förhållanden 10, 12, 23, 24, 25, 26, och några få har testats i AD och / eller PD 11, 27, 28 . MSA och PSP är atypiska parkinson-störningar och har en klinisk manifestation som mycket liknar PD 29 . Så vitt vi vet har ingen undersökning av RG-urval hittills genomförts på MSA eller PSP. Följaktligen är bedömning av stabila RG: er för jämförande studier på PD, MSA och PSP mycket relevant för att stärka tillförlitligheten hos det experimentella resultatet. Även om PSP är kliniskt jämförbart med PD, liknar de patologiska händelserna i PSP 30 AD. Vi undersökte två sjukdomspåverkade hjärnregioner, medial frontal gyrus i prefrontalbarken (PFC) och cerebellum (CB), för att definiera den mest stabila uppsättningen av RG för jämförande genuttrycksstudier i PD, MSA, PSP, och AD-hjärnor. Följande gener undersöktes (tabell 1): GAPDH , ACTB , ribosomalt protein stort 13 ( RPL13 ), hypoxanfin fosforibosyltransferas ( HPRT1 ), cytrokrom C1 ( CYC1 ), topoisomeras 1 ( TOP1 ), eukaryot translation initieringsfaktor 4A2 ( EIF4A2 ), ß-2-mikroglobulin ( B2M ), pumilio-homolog 1 ( PUM1 ), TATA-box-bindande protein ( TBP ), ubiquitin C ( UBC ), cyklofilin A ( PPIA ), succinat-dehydrogenas-komplex underenhet A ( SDHA ), ATP-syntas H + transport av mitokondriell F1-komplex beta-polypeptid ( ATP5B ) och ubikitin-konjugerande enzym E2D2 ( UBE2D2 ). Vidare inkluderades glykogensyntas-kinas 3P ( GSK3B ) som en intressant gen (GOI) för att validera påverkan av RG-valet på normalisering av genuttrycksdata.

Full storlek bord

Resultat

Effektivitet för förstärkning av RT-qPCR-primer

Primereffektivitet beräknades för varje kandidat-RG och varierade mellan 90, 4% och 107, 6% med användning av minst fyra punkter på standardkurvan med R2-värden inom intervallet 0, 992 till 1 000 (tabell 1). Varje reaktion avslutades med en smältkurvanalys mellan 55 och 95 ° C för PCR-produktutvärdering (fig. S1). Om smältkurvanalys identifierade närvaro av primerdimerer tillsattes ett ytterligare anskaffningssteg i varje PCR-cykel (tabell 1) eftersom primer-dimerer inte genererar signal i fluorescens som fångats över 76 ° C. På grund av låga uttrycksnivåer i båda hjärnregionerna (cykeltröskel (Ct) medelvärde > 35) och eftersom det inte var möjligt att uppnå god effektivitet för HPRT1 och SDHA ingick generna inte i de efterföljande stabilitetsmätningarna.

Beskrivande statistik över RG: s kandidater

Nästan alla kandidat-RG visade signifikant avvikande uttrycksnivåer mellan sjukdomsgrupperna i båda hjärnregionerna, med undantag av RPL13, EIF4A2, B2M och UBC i PFC, som inte visade några signifikanta skillnader mellan grupperna (Fig. 1). Ct-värden för de 13 inkluderade kandidat-RG: erna i PFC och CB för alla fem grupper varierade mellan 19, 9 och 38, 7 (fig. 1, tabell 2). Standardavvikelserna (SD) varierade mellan 0, 66 och 3, 09 (tabell 2). I PFC hade EIF4A2 de lägsta expressionsnivåerna (medelvärde Ct (Ct- medelvärde ) = 32, 6) följt av TBP (Ct- medelvärde = 31, 5) och B2M (Ct- medelvärde = 30, 3). I CB PUM1 (Ct medelvärde = 32, 8), uppvisade TOP1 (Ct medelvärde = 31, 0) och TBP (Ct medelvärde = 30, 9) de lägsta uttrycksnivåerna. Generna med de högsta expressionsnivåerna var i båda hjärnregionerna RPL13 (Ct- medelvärde, PFC = 25, 0 och Ct- medelvärde, CB = 23, 5) och PPIA (Ct- medelvärde, PFC = 25, 7 och Ct- medelvärde, CB = 27, 1). I alla grupper visade EIF4A2 de mest variabla uttrycksnivåerna i båda regionerna reflekterade av medel-SD (SD- medelvärde, PFC = 2, 18 och SD- medelvärde, CB = 1, 80). I båda hjärnregionerna var RG-kandidaterna som uppvisade den lägsta variationen i uttrycksnivåer TBP (SD- medel, PFC = 1, 21 och SD- medelvärde, CB = 1, 09), PUM1 (SD- medelvärde, PFC = 1, 24 och SD- medelvärde, CB = 1, 05) och RPL13 (SD- medelvärde, PFC = 1, 33 och SD- medelvärde, CB = 1, 24).

Image

Kartong- och visp-diagram som visar RT-qPCR-mRNA-expressionsnivåer avbildade som råa Ct-värden i det prefrontala cortex ( A ) och cerebellum ( B ) för all Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Multiple System Atrophy (MSA), Progressive Supranuclear Pares (PSP) och normala, icke-dementa kontroller (NC). Lådor visar den 25: e, 50: e och 75: e percentilen; whiskers visar minimi- och maxvärden för varje RG. p- värden indikerar ANOVA-signifikansnivåerna.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Sammanfattande omfattande ranking

Baserat på resultatet från RefFinder-mjukvaran (för alla resultat, se Excel S1) tilldelades kandidat-RG: er en rangordning från 1 till 13 (1 var den mest stabila RG i den givna kombinationen av sjukdomsgrupper och 13 var den minst stabila; Excel S1). När vi integrerade alla olika kombinationer för alla sjukdomsgrupper som ingår i studien fann vi att CYC1 och UBE2D2 i båda hjärnregionerna var de mest stabila RG: erna (fig. 2). De minst stabila RG-kandidaterna i PFC var GAPDH och EIF4A2, medan EIF4A2 och TOP1 rankades som de minst stabila i CB. Vidare betraktades de sammanfattade, omfattande rankningarna för både hjärnregioner och alla individer kollektivt. CYC1 , UBE2D2 och RPL13 rankades bland de sex mest stabila RG: erna, såsom illustreras i fig. 3A. Av de sju mest instabila RG: erna identifierades EIF4A2 , B2M , UBC och ACTB i både PFC och CB (Fig. 3B). De totalt sett tre mest stabila RG: erna som identifierats i denna studie är CYC1 , UBE2D2 och RPL13 (Fig. 3).

Image

Sammanfattad genstabilitetsrankning för alla individer i prefrontalbarken ( A ) och hjärnbotten ( B ). Sammanfattade rangordningar från RefFinder. Lägre rangordning indikerar högre stabilitet.

Bild i full storlek

Image

Ven-diagram som visar överlappningen mellan de sex mest stabila ( A ) och sju minst stabila ( B ) referensgenerna i både den prefrontala cortex (ljusgrå) och hjärnbotten (mörkgrå). Ven-diagrammet är baserat på den sammanfattade omfattande rankningen från RefFinder.

Bild i full storlek

Valgen av referensgen

För att demonstrera påverkan av RG-valet på RT-qPCR-datanormalisering analyserades målgen GSK3B- expressionsnivåer i både PFC och CB, mellan NC: er och AD (Fig. 4A, B), NC: er och PD (Fig. 4C, D), såväl som mellan alla grupper (Fig. 4E – J). För varje kombination av sjukdomsgrupper normaliserades data till tre distinkta uppsättningar av RG: 1) GAPDH och ACTB , de två mest använda RG: erna; 2) de två RG-kandidaterna som i våra analyser visade den lägsta stabiliteten för den givna kombinationen av sjukdomsgrupper; och 3) de tre mest stabila RG-kandidaterna som i vår analys visade den högsta stabiliteten för den givna kombinationen av sjukdomsgrupper. Genuttrycksnivåerna uppmätta för GSK3B påverkades signifikant av valet av RG: er som användes för normalisering (fig. 4, sammanfattat i tabell 3).

Image

GSK3B- expressionsnivåer analyserades med användning av de vanliga RG-valen ( GAPDH och ACTB ) i kombination, med användning av de två lägst rankade generna i kombination och med användning av de tre bäst rankade generna i kombination. ( A) och B ) visar jämförelse av RG-val för normala, icke-dementa kontroller (NC) och Alzheimers sjukdom (AD), ( C) och ( D ) för NC-patienter och Parkinsons sjukdom (PD) -patienter, ( E – H) ) för alla grupper. ( A, C, E, G) och ( I ) visar jämförelser för den prefrontala cortex och ( B, D, F, H ) och ( J ) för cerebellum. Alla data presenteras som de relativa uttrycksnivåerna som är normaliserade till de mest stabila RG: erna beräknade för varje kombination av sjukdomsgrupper i respektive områden, och data visas i förhållande till expressionsnivåer i NC. MSA: Multipla systematrofipatienter; PSP: Progressiva Supranuclear Pares patienter. Data presenteras som medelvärde ± SEM. * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Den största effekten på resultaten ses för analysen av data från NC: s vs AD. Uttrycket av GSK3B regleras signifikant i AD när det normaliseras till de vanligaste RG: erna och de minst stabila RG: erna i PFC (Fig. 4A) och till de vanligaste RG: erna i CB (Fig. 4B). Men när vi normaliserade GSK3B- expressionsnivåerna till de mest stabila RG: erna som erhölls genom våra analyser, försvann den relativa betydelsen mellan grupperna i PFC (fig. 4A) eller byts ut i CB (fig. 4B). För NC: s vs PD-normalisering till de vanligaste, och de mest stabila RG: erna resulterade i liknande utfall, men SD: er när man använde de mest stabila RG: n minskade (Fig. 4C, D). När alla grupper analyserades tillsammans och GSK3B- nivåerna normaliserades till de mest stabila RG: erna såg vi de mest lika, minst divergerande resultaten mellan grupperna (Fig. 4I, J). En hög ökning av GSK3B- nivåer i AD-gruppen jämfört med andra grupper observerades i PFC för data normaliserade till både de minst stabila RG: erna (Fig. 4G) och de vanligaste RG: erna (Fig. 4E). Omvänt observerades minskade nivåer av GSK3B hos AD-patienterna jämfört med NC: er när de minst stabila RG: erna användes för datanormalisering i CB (Fig. 4H), medan inga skillnader identifierades i CB för de mest stabila RG: erna. 4J).

Korrelationsanalyser

Betydande skillnader i RNA-integritetsnummer (RIN) -värden, ålder och post-mortem-intervall (PMI) observerades mellan grupper (tabell 4). För att utvärdera påverkan av dessa faktorer på expression av GSK3B korrelerades råa Ct-värden och Ct-värden normaliserade till de mest stabila RG: erna till RIN-värden, ålder och PMI (tabell S3). Ingen av de livskraftiga faktorerna visade signifikant korrelation till uttrycket av GSK3B .

Full storlek bord

Diskussion

Vår studie är den första som ger en omfattande utvärdering av vanliga RG: er för RT-qPCR för jämförande studier av fyra neurodegenerativa sjukdomar: Två mycket undersökta sjukdomar, AD och PD, tillsammans med två sällsynta sjukdomar, MSA och PSP. Det finns en allmän enighet om användningen av HKG som RG, men det har blivit tydligare att antagandet om RG-stabilitet inte är konsekvent när experimentella förhållanden ändras. Därför håller vi med andra om att optimalt, val av de mest giltiga RG: erna bör utföras individuellt för varje experimentell uppsättning 31 såväl som den undersökta vävnaden, organ och region, sjukdom, art och så vidare 11 . Ytterligare faktorer såsom primereffektivitet, primersekvenser, cDNA-syntesprotokoll och grundläggande experimentella skillnader kan också påverka resultatet i RG-stabilitet och bör därför också beaktas. Flera andra faktorer har också visat sig påverka resultatet från mRNA-studier, inklusive nedbrytningsgrad 32, 33, PMI: er 34 och patientens ålder 35 . Som föreslagits av minimiinformationen för publicering av kvantitativa realtidsexperiment (MIQE) riktlinjer bör 36 RNA-fragmentering erhållas för varje mRNA-prov som används för RT-qPCR. Ett sätt att uppnå detta är genom att bestämma RIN-värden 37 . Det är viktigt att få RIN-värden så höga som möjligt, som gjorts i denna studie, med en tröskel på 3, 95 som rekommenderas för studier efter mödre 38 . Korta amplikoner (under 250 baspar) är emellertid mindre beroende av RIN-värden 33 . Vidare kan några av de problem som är förknippade med låga RIN-värden kringgås med användning av interna RG: er för datanormalisering tillsammans med att uttrycka resultatvärden relativt en intern standard (ΔΔCt-metoden 39 ) med korrigering för PCR-effektivitet 32 . RIN-värden har visat sig korrelera negativt med PMIs 34, men vi identifierade inte ett inflytande av varken PMI: er eller ålder på RIN-värden (Fig. S2). Vi bekräftade vidare att de råa eller normaliserade Ct-värdena för GSK3B- expressionsnivåer inte korrelerade med någon av dessa faktorer i båda hjärnregionerna. Således kan vi dra slutsatsen att genom att tillämpa rekommendationerna från MIQE-riktlinjerna och genom att implementera försiktighetsåtgärderna i den experimentella designen som beskrivs här, kunde vi utföra relativ kvantifiering av genuttrycksnivåer med en minimal risk för falsk tolkning av resultaten.

Som nämnts ovan varierade PMI betydligt mellan grupper. Proverna som användes i denna studie härstammade från tre olika hjärnbanker placerade i Danmark, Nederländerna och USA. Variationerna i PMI beror främst på skillnader i nationella lagstiftning angående PMI, varefter utvinning av mänskliga hjärnor är tillåten, och det är därför svårt att kringgå. Eftersom våra resultat inte visade några signifikanta korrelationer mellan PMI och RIN, ålder, råa Ct-värden eller normaliserade Ct-värden, stöder denna studie dessutom att inkludering av mänskliga hjärnprover från olika källor är genomförbart även för stora skillnader i PMIs.

Vi använde RefFinder-programvaran i denna studie för dataanalys. Programvaran kombinerar fyra av de mest använda algoritmerna för bestämning av stabiliteten för genuttryck (Genorm, NormFinder, BestKeeper och ΔCt-metoden), men RefFinder delar inte alla funktioner som ingår i de fristående applikationerna. Exempelvis förmågan hos Genorm att definiera det optimala antalet RG med hjälp av ett förutbestämt avgränsningsvärde som bestämmer hur mycket att lägga till ytterligare RG till analyserna påverkar den grupperade stabiliteten hos de bäst rankade RG 16 . Men som redan nämnts någon annanstans, 16, 40, bör användning av minst tre RG vara lämpligt, och vi anser därför inte frånvaron av denna funktion i RefFinder vara av relevans för vår analys. RefFinder tar inte hänsyn till primereffektiviteten, en funktion som ingår i de fristående applikationerna Genorm, NormFinder och BestKeeper. För att korrigera detta justerade vi de råa Ct-värdena för effektivitet manuellt före analys. Detta har tidigare visat sig göra resultat som erhållits med RefFinder-programvaran jämförbara med de som erhållits med fristående applikationer 22 . Liknande och jämförbara utvärderingar erhålls från Genorm, NormFinder och ΔCt-metoderna, med avvikelser för vissa gener erhållna från BestKeeper. Detta är överraskande eftersom tidigare fynd visade lika stabilitetsrankning för Genorm, NormFinder och BestKeeper 21, 22 . En förklaring kan vara det så kallade BestKeeper-indexet, ett verktyg som endast BestKeeper tillämpar. Detta index är det geometriska medelvärdet av Ct-värdena för alla kandidat-RG: er grupperade tillsammans. Genen med den högsta korrelationskoefficienten med indexet indikerar således den högsta stabiliteten. Trots dessa små skillnader var resultaten av de bästa RG-kandidaterna överensstämmande mellan de olika tillämpade metoderna.

I denna studie har vi använt olika tillvägagångssätt för att bedöma RG-kandidatens stabilitet. Hade vi bara använt beskrivande statistik med de enda kriterierna som användes var minimal variation i uttrycksnivåerna i varje grupp följt av låga skillnader mellan sjukdomsgrupper, TBP , PUM1 och RPL13 skulle vara de föredragna valen i både PFC och CB i denna studie. Även om RPL13 rankas bland de fyra mest stabila RG: erna enligt de sammanfattade rankningarna, rankas TBP bland de tre minst stabila RG: erna och det skulle därför vara otillräckligt att använda, medan PUM1 verkar vara en mellanliggande RG. För att utvärdera kandidat-RG baserat på ett brett spektrum av lika viktiga parametrar behövs således mer avancerade metodiska och statistiska tillvägagångssätt.

Enligt våra analyser med RefFinder rankades CYC1 , UBE2D2 och RPL13 bland de sex mest stabila RG: erna, medan EIF4A2 , B2M , UBC och ACTB var bland de mest instabila RG: erna. CYC1- och UBE2D2-proteiner påverkas i åtminstone AD och / eller PD 41, 42, 43, men detta är uppenbarligen irrelevant för genuttrycksstabiliteten. CYC1-proteinet är en del av den mitokondriella elektrontransportkedjan och är således avgörande för cellulär respiration 44 . UBE2D2-proteinet är ett ubiquitinkonjugerande enzym som har föreslagits som ett allmänt HKG tillsammans med proteiner med liknande funktioner 45 . Våra resultat för UBE2D2 hittar support någon annanstans 27 . Så vitt vi vet har varken gentranskription eller proteinnivåer i ribosomal 60S-underenhet RPL13 rapporterats påverkas i någon av de sjukdomar som ingår i denna studie.

Som misstänkt visade GAPDH och ACTB sig inte som stabila RG i våra analyser. GAPDH-protein är ett katalytiskt enzym som är involverat i glykolys och är därför viktigt för cellmetabolismen 46 . På grund av denna vitala funktion har GAPDH troligen varit ett av de primära valen som RG i RT-qPCR-studier i mer än två decennier. Emellertid har GAPDH-protein och dess aktivitet visat sig påverkas i AD 8 och PD 9, och allmänna GAPDH- transkriptionsnivåer har visat sig variera mycket mellan olika vävnadsfack 47 . Våra data indikerar att GAPDH inte är en stabil RG i varken PFC (rankad 12: e ) eller CB (rankad 6: e ). ACTB-protein är en av sex olika humana aktinisoformer och är en av de två cytoskeletala aktinerna utan muskel 48 . ACTB har också använts i stor utsträckning som RG i flera år. I våra studier rankas ACTB på 7: e respektive 9: e plats i PFC respektive CB, och det rekommenderas därför inte för användning som RG i liknande experimentella inställningar.

Slutligen, för att validera hur valet av RG: er påverkar RT-qPCR-resultat, jämförde vi GSK3B- mRNA-nivåer mellan olika kombinationer av sjukdomsgrupper. GSK3B reglerar flera olika cellulära processer, och GSK3B- dysregulering har varit inblandad i patogenesen för både AD och PD 49 . Betydande avvikelser inträffade i det relativa transkriptionsflödet av GSK3B när de normaliserades till olika uppsättningar av referensgener. Generellt ses stora variationer i det relativa uttrycket av GSK3B när de vanligaste, GAPDH och ACTB , eller de minst stabila RG: erna används för normalisering. Omvänt, när de mest stabila RG: erna används, minimeras relativa skillnader i mRNA-nivåer mellan grupperna. Med tanke på att GAPDH och ACTB visade sig vara instabila RG, bekräftar spridningen mellan dessa observationer vikten av att använda de adekvata RG: erna för att undvika falska resultat.

Sammanfattningsvis undersöktes uttrycksprofilerna och stabiliteten för 13 vanligt använda RG i hjärnprover från fyra olika neurodegenerativa störningar (AD, PD, MSA och PSP) och NC: er i två distinkta hjärnregioner (PFC och CB) med användning av sex olika statistiska metoder ( beskrivande statistik, Genorm, NormFinder, BestKeeper, ΔCt-metod och RefFinder). Vidare utvärderades det relativa uttrycket av den sjukdomsassocierade genen GSK3B med användning av olika uppsättningar av RG. Detta tillvägagångssätt validerade påverkan som valet av RG: er har på studieresultatet och underströk vikten av att välja de mest stabila RG: erna för att korrekt kvantifiera genuttrycksnivåer. Vi föreslår att du utför grundliga analyser av RG-val för varje vävnad, sjukdom och experimentell installation före huvudexperimentet. Baserat på resultaten från denna studie rekommenderar vi att du använder UBE2D2, CYC1 och RPL13 i kombination för studier relaterade till hjärnvävnad och till de sjukdomar som ingår här. Vidare har vi gett flera viktiga överväganden beträffande valet och bedömningen av RG: er i RT-qPCR-studier. Denna rapport bör därför ses som en riktlinje för hur man utför validering av RG för att förstärka tillförlitligheten hos RT-qPCR-resultat.

metoder

Källa till mänsklig hjärnvävnad

Hjärnprover efter mortem från den mediala frontala gyrusen hos PFC och CB (tabellerna S1 och S2) donerades generöst av hjärnbanken på sjukhuset Bispebjerg-Frederiksberg (Köpenhamns universitet; godkänd av Danska dataskyddsverket, j.no BBH-2010-06, I-suite 00971), Nederländska hjärnbanken (Nederländska institutet för neurovetenskap) och Harvard Brain Tissue Resource Center (Harvard Medical School Teaching Hospital) (tabell S1). Alla prover undersöktes histologiskt för att bekräfta patologi och diagnos. En signifikant skillnad i ålder i MSA-gruppen observerades på grund av deras tidigare sjukdomstillfällen och dödsfall (tabell 4). Alla hjärnprover samlades in och hanterades i enlighet med danska etiska standarder och de danska hälso- och medicinmyndigheterna. Detta projekt godkändes av Region Hovedstadens etiska kommitté, tidskrift nr. H-16.025.196. Informerat samtycke erhölls från alla givare. Prover lagrades vid -80 ° C före total RNA-extraktion.

RNA-isolering och cDNA-syntes

RNA-isoleringen och de efterföljande RT-qPCR-reaktionerna utfördes enligt MIQE-riktlinjerna 36 . Total RNA-extraktion utfördes med användning av antingen Qiagen RNeasy Lipid Tissue Mini Kit eller Qiagen AllPrep DNA / RNA / miRNA Universal Kit enligt tillverkarens instruktioner. Före RNA-extraktion homogeniserades hjärnprover med användning av ett MagNA Lyser-instrument (Roche Diagnostics) och de relaterade MagNA Lyser-gröna pärlorna (Roche) vid 2 × 6, 5 k varv per minut under 25 sekunder i 1 ml förkylt Qiazol-reagens som levererades med extraktionssatsen . RNA-kvalitet och koncentrationer utvärderades med användning av 2100 Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies) med användning av RNA 6000 Nano-kit (Agilent Technologies) enligt tillverkarens instruktioner. RNA-renhet bedömdes med användning av en NanoDrop 2100 (Thermo Scientific). RNA-koncentrationer varierade från 0, 04–1, 10 μg / μl och RIN-värden från 4, 0–7, 8. En avgränsningströskel på RIN = 3, 95 baserat på 34, 38 och en optisk densitet vid våglängden 260/280 nm intervall 1, 8–2, 2 valdes för denna studie 36 . Alla RNA-prover underkastades DNas-spjälkning med användning av Turbo-DNA- fritt TM- kit (Ambion) och testades därefter för DNA-kontaminering i RT-qPCR med användning av GAPDH-primerset (tabell 1). Ensträngat cDNA syntetiserades från 100 ng totalt RNA med användning av qScript cDNA SuperMix-kit (Quanta) enligt tillverkarens instruktioner. cDNA-koncentrationer mättes på en NanoDrop 2000 och utspäddes till 100 ng / mL i RNas-fri H20.

Val av kandidatreferensgener och PCR-primerdesign

15 förmodade RG: er valdes för utvärdering av deras stabilitet i varje patientgrupp och i jämförelser av patientgrupper. RG: erna valdes baserat på deras stora användning i litteraturen och i kommersiella genarray-satser. Sex grundpar anpassades från litteraturen: ATP5B 50, TOP1 51, PPIA 52, PUM1 53, TBP och UBE2D2 54 . För alla andra gener designades primerpar de novo med användning av Primer-BLAST (NCBI) och Oligo 7 (Molecular Biology Insight, Inc.). Primers syntetiserades av TAG Copenhagen A / S. För varje grundpar (tabell 1) bestämdes och beräknades den optimala glödgningstemperaturen, amplifieringseffektiviteten och R2 med användning av MxPro-programvarupaketet (Agilent Technologies).

Omvänd transkriptas halvkvantitativ realtid PCR (RT-qPCR)

Alla prover kördes i dubbletter. I korthet utfördes RT-qPCR-reaktioner med användning av Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) på ett Stratagene Mx3005p qPCR-system (Agilent Technologies). Den slutliga volymen för varje reaktion var 10 | il med 300 nM (400 nM för TOP1 ) av motsvarande genspecifika primrar (tabell 1) och 1 ul totalt cDNA. Ett positivt kontroll / kalibrator-cDNA-prov syntetiserat från kommersiellt tillgängligt Human Universal Reference Total RNA (hRNA; Clontech) inkluderades på varje platta. En negativ vattenkontroll inkluderades i varje körning. Den termiska cykeln initierades vid 95 ° C under 20 sekunder följt av 40 cykler på 5 s vid 95 ° C och 30 s vid den optimala glödgningstemperaturen för varje gen (tabell 1). Om primer-dimerer observerades, tillsattes ett ytterligare anskaffningssteg under 15 sekunder i varje cykel för att undvika detektering av primerdimerer (tabell 1 och fig. S1). Dissociationskurva-analyser utfördes i slutet av varje körning för PCR-produktverifiering (Fig. S1).

Dataanalys

Stabiliteten för RG-kandidaterna var tillgängliga med fyra metoder: Genorm 16, NormFinder 18, BestKeeper 17 och den jämförande ativeCt-metoden 15 kombinerade i online-paketet RefFinder som innehåller en övergripande omfattande analys av de fyra metoderna 20 (//fulxie.0fees). oss). De genomsnittliga Ct-värdena för varje prov normaliserades med användning av en Human Universal Reference cDNA som en kalibrator såsom beskrivits av 39 . Vidare korrigerades Ct-värdena för effektiviteten för varje gen. Relativa mängder beräknades med hjälp av geometrisk medelvärde av flera referensgener 55 .

Statistik

Data visas som medelvärde ± SEM. Gaussisk distribution utvärderades med användning av D'Agostino-Pearson omnibus-normalitetstest. Homogenitet av varians utvärderades med användning av Levens test. Outliers avlägsnades med hjälp av ROUT-proceduren med maximal falsk upptäcktsfrekvens (FDR) Q = 1%. Statistiska analyser utfördes i GraphPad Prism 6.01 (GraphPad Software) och Real Statistics Resource Pack-mjukvaran v. 4.8 med användning av icke-parade parametriska Studenters t- test, Welch's t- test för ojämlika varianser, envägs ANOVA följt av Tukeys multipla jämförelseområde test, Welchs ANOVA följt av Games-Howell post hoc-test, och Bonferroni korrigerade Pearson-produktmomentkorrelation eller Mann-Whitney U- test, och Bonferroni korrigerade Spearman rankningskorrelation. Chi-kvadrat-test användes för att bedöma könsfrekvensen. p- värden under 0, 05 ansågs statistiskt signifikanta.

ytterligare information

Anslutningskoder: ATP5B (NM_001686), B2M (NM_004048), PPIA (NM_021130), CYC1 (NM_001916), EIF4A2 (NM_001967), GAPDH (NM_002046), PUM1 (NM_014676), RPL13 (NM_000977), TB (94) NM_003286), UBC (NM_021009), UBE2D2 (NM_003339), ACTB (NM_001101), GSK3B (NM_002093).

Hur man citerar den här artikeln : Rydbirk, R. et al. Bedömning av hjärnreferensgener för RT-qPCR-studier i neurodegenerativa sjukdomar. Sci. Rep. 6, 37116; doi: 10.1038 / srep37116 (2016).

Förlagets anmärkning: Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande databas 1

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.