Antibiotika och morfogenes i njurgren: jämförelse av toxicitet | pediatrisk forskning

Antibiotika och morfogenes i njurgren: jämförelse av toxicitet | pediatrisk forskning

Anonim

ämnen

  • Pediatrisk forskning

Abstrakt

Bakgrund:

Många för tidigt födda nyfödda får antibiotika för att behandla infektioner, som appliceras under aktiv nefrogenes. Vi studerade effekterna av kliniska koncentrationer av gentamicin och alternativ, ceftazidim och meropenem, på ureterisk förgrening.

metoder:

Mössmetanephroi dissekerades vid embryonal dag 13 och odlades i media med eller utan olika koncentrationer av gentamicin, ceftazidim eller meropenem. Nollstorlek och 24 timmar njurstorlek utvärderades genom mätningar av ytarean, och det ureteriska trädet visualiserades genom helfärgningsfärgning och konfokal mikroskopi. Förgrening utvärderades genom räkning och genuttrycksnivåer av Wtl , Sox9 , Bmp7 , Fgf8 och Gdnf undersöktes.

Resultat:

En koncentration på 2 000 μmol / l ceftazidim försämrade ureterutvecklingen. Dessutom noterades en 4, 5-faldig och en 2, 5-faldig nedreglering i Fgf8 respektive Gdnf . Inga biverkningar noterades efter gentamicin- eller meropenembehandling. Inget samband observerades mellan ytareautvidgning och ureterisk knoppbildning, men ytarea vid explantation relaterat till knoppantalet efter 24 timmars kultur.

Slutsats:

Ceftazidim men inte gentamicin eller meropenem minskade ureterisk förgrening hos möss och föreslår en roll för Fgf8 och Gdnf i dess mekanism. Metanephros-ytmätningar kan användas för att minska variationen mellan kullarna och kullarna.

Huvudsaklig

Njurutveckling, vilket leder till bildandet av nefroner, börjar omkring femte veckan av dräktigheten och upphör före födseln, omkring den 34–36: e graviditeten. Många faktorer har beskrivits för att störa denna utvecklingsprocess, vilket leder till långvariga problem som hypertoni och kronisk njursjukdom (1).

En sådan störande faktor kan vara användningen av (nefrotoxiska) läkemedel under utvecklingen av njurarna, till exempel hos gravida kvinnor eller nyfödda födda före avslutandet av nefrogenes. Gentamicin, liksom andra aminoglykosider, används i stor utsträckning som en del av den första linjebehandlingen av (misstänkt) bakteriell infektion i nyfödda för att bekämpa Gram-negativa infektioner. Baserat på data från det nederländska perinatala registret, behandlas 62% av nyfödda födda före 32 veckor, som kan betraktas som den mest utsatta gruppen, med aminoglykosider (2). På grund av det faktum att gentamicin klassificeras som ett nefrotoxiskt läkemedel kvarstår kontroverser om dess säkerhet eftersom aminoglykosider har visat sig störa njurutvecklingen och leda till ett minskat nefronantal hos vissa försöksdjur (3, 4, 5, 6) och organkulturstudier (7).

Syftet med vår forskning var att studera påverkan av antibiotikabehandlingar på nefrogenes i en modell av tidig nefrogenes. Gentamicin studerades såväl som kliniskt relevanta, alternativa läkemedelsbehandlingar för att jämföra dessa läkemedels toxiska potential i ett kliniskt dosintervall. Som alternativa behandlingar valde vi en tredje generation cefalosporin, ceftazidim och karbapenem meropenem. Dessa två läkemedel har båda egenskaper att hantera Gram-negativa bakterier och har olika verkningsmekanismer jämfört med gentamicin. Även om beta-laktamer har sina egna krafter för att vara nefrotoxiska, kan ceftazidim ges i en ganska hög dos innan proximal tubuluskada märks (8). När det gäller meropenem betraktas detta läkemedel som ett av de säkrare karbapenemema (9) på grund av dess stabilitet mot renal dehydropeptidas-I (10), vilket bekräftades i en stor klinisk studie (11). Även om dessa alternativ till gentamicin verkar ganska säkra, saknas information om de potentiella toxiska effekterna på morfogenes av njurgrenad. Vi ansåg att gentamicin skulle hämma tidig utveckling av njurarna och ceftazidim och meropenem skulle visa sig vara säkra.

Resultat

Metanefrisk tillväxt

Först studerade vi nyttan av tillväxt på ytan som en bra markör för njurutveckling. Baserat på tidigare studier (7, 12, 13), förväntades ett samband mellan utvidgning av metanefrisk storlek och ureteriskt spetsantal, en mer direkt mätning av njurutvecklingen. Såsom kan noteras i figur 1a korrelerade emellertid ytutvidgningen inte med ureterisk spetsbildning (R2 = 0, 005, P = 0, 77) och användes därför inte som markör i våra studier.

Image

Korrelation (med 95% konfidensintervall) mellan mätningar av ytarea och ureterisk knoppbildning ( a ) efter 24 timmars organkultur och ( b ) vid explantation. Pearssons korrelationskoefficienter var R2 = 0, 005228 och R2 = 0, 5082 för a respektive b .

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Dessutom noterade vi en variation i metanefrisk storlek inom ett kull (upp till 11%) och mellan våra kullar (± 20%), baserat på skillnader i ytarea uppmätt direkt efter explantering. Effekten av denna variation på ureterisk knoppspetsräkning efter 24 timmar studerades. Som man kan se i figur 1b noterades en signifikant korrelation mellan metanefrinstorlek och ureterisk knopputveckling (R2 = 0, 5, P <0, 01). Baserat på detta fynd korrigerades alla ureteriska spetsräkningar med avseende på metanefrisk ytarea vid explantering.

Ureteric Tip Imaging

Ureterisk spetsutveckling studerades i de tre olika antibiotikaklasserna. Ett intervall av tre doser testades för att utvärdera det breda läkemedelssvaret och undersöka ett möjligt dosresponsförhållande ( figur 2 ).

Image

Kvantitativ analys av ureteriska knoppar i metanephroi odlade under 24 timmar i media med tre antibiotika, dvs ( a ) gentamicin, ( b ) ceftazidim och ( c ) meropenem. Individuella datapunkter samt medel per behandlingsgrupp presenteras. En låg, klinisk och hög koncentration testades. Provstorlekar av behandlingsgrupper var mellan 15 och 27; 10 och 15; och 10 och 13 för gentamicin, ceftazidim respektive meropenem. * P <0, 01.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Som kan noteras i figur 2b, resulterade endast ceftazidimkoncentrationen 2 000 umol / l i ett statistiskt signifikant lägre ureteriskt spetsantal efter 24 timmars exponering (28, 37 mot 48, 16, P <0, 01). Denna effekt var också tydligt detekterbar visuellt ( figur 3 ). Inga effekter på utvecklingen jämfört med kontrollen observerades vid lägre och medelstor dos. I våra experiment med gentamicin ( figur 2a ) noterades en trend mot ett lägre ureteriskt spetsantal. Meropenembehandling ( figur 2c ) visade inte någon effekt på ureterisk spetsutveckling jämfört med kontroll vid någon av de studerade koncentrationerna.

Image

Representativ immunohistokemisk färgning av ureterisk knopputveckling i metanephroi odlad under 24 timmar i media med ( b ) 2 000 umol / l ceftazidim eller ( a ) kontroll av fordonet.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Genuttrycksanalys

Vi studerade ett urval av mål i kända nefrogenes- och apoptosvägar genom mRNA-uttrycksanalys ( figur 4 ). Robusta CT-nivåer indikerade att målen fanns i våra metaneferiska organkulturer.

Image

Genuttryck av viktiga mål för nefrogenesvägar i metanephroi odlade under 24 timmar i media med tre antibiotika, dvs ( a ) gentamicin, ( b ) ceftazidim och ( c ) meropenem. Med SEM presenteras för ( a ) två eller ( b, c ) tre experiment, med undantag för kaspasmålen, som gjordes i två experiment. Testade koncentrationer var 30 (vita staplar) och 300 / xmol / l (svarta staplar) för gentamicin, 200 (vita staplar) och 2 000 | imol / l (svarta staplar) för både ceftazidim och meropenem. Sex till nio metanephroi slogs samman per experiment.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Behandling med ceftazidim i en koncentration av 2 000 umol / l resulterade i en 2, 5-faldig nedreglering av Gdnf mRNA, en välkänd faktor i den ureteriska förgreningsvägen (14). Dessutom noterades en 4, 5-faldig nedreglering av Fgf8- mRNA ( figur 4c ). Inga förändringar i expressionsmönster noterades efter behandling med 200 | imol / l ceftazidim. Gentamicin- eller meropenembehandling påverkade inte mRNA-nivåerna för våra valda mål. Vidare förblev mRNA-nivåer av Caspase 3 och Caspase 9 lika mellan kontroller och högdosbehandling av gentamicin och ceftazidim.

Diskussion

Vi har visat att en övre klinisk intervallkoncentration av ceftazidim minskar ureterisk förgreningsmorfogenes och föreslår en roll för Fgf8- och Gdnf- vägar i dess toxicitet. Inga biverkningar av gentamicin och meropenem inom deras postulerade kliniska dosintervall noterades på ureterisk förgrening eller grundläggande nefrogenesvägar.

Tidigare rapporter har använt utvidgningen av ytan som ett mått för njurutvecklingen (7, 12, 13). Vår studie visar ingen korrelation mellan ytutvidgningen och en mer direkt utvecklingsmarkör för njurar, såsom ureterisk knopp. Denna brist på korrelation kan förklaras genom utplattning av metanephros i organkultur och dess partiella förlust av tredimensionell struktur som tidigare har rapporterats (15). Påverkan på faktiska mätningar hade emellertid inte studerats. Vi visar att mätningar av ytan under de första 24 timmarna efter explantering inte är en korrekt markör för njurutveckling.

Även om utplattning av organets rudiment under organodling gör ytanalysen ohjälpsam för kvantifiering av njurutveckling, kan ytarea vid explantation delvis förutsäga mängden tips som kommer att utvecklas i metanephroi. Vi hittade en signifikant korrelation mellan ytarean med explantatstorlek direkt efter dissektion och mängden ureterpipar räknade efter 24 timmar. Man kan förvänta sig en sådan korrelation eftersom njurutvecklingen är mer uttalad i utero än i organkultur (16). Därför kan en mer utvecklad (och därför grenad och större) metanefros vid dissektionstillfället förväntas ha fler slutspetsar efter 24 timmars tillväxt. Dessa data möjliggör korrigering av variation i graviditetsålder. Genom att använda vår korrelation för att korrigera alla ureteriska spetsräkningar för det uppmätta ytområdet efter explantation, kommer variationen i utvecklingsstadiet att vara mer begränsad, och mer exakta jämförelser mellan dosgrupper, men också mellan kullar kan erhållas.

Vår första forskningsfråga var om kliniska relevanta nivåer av gentamicin kunde påverka nefrogenes och om andra klasser av antibiotika kan vara säkrare.

Gentamicins potential att påverka nefrogenes har redan fastställts hos råtta. Studier utfördes mest genom antingen maternär dosering (3, 4, 5) eller postnatal dosering (3, 17). I dessa studier noterades ingen effekt av gentamicin på njurutvecklingen efter tidig postnatal dosering under aktiv nefrogenes. Emellertid bekräftades ansamling av gentamicin i mödrarna i fostrets njure. Dessutom resulterade exponering för gentamicine i utero i en minskning av glomerulärt antal upp till 20% och förändringar i den rörformiga strukturen. Dosen som administrerades till de gravida kvinnorna i dessa studier var emellertid 75 mg / kg och var nästan 20 gånger högre än den 4 mg / kg kliniska dosen som vi extrapolerade dosnivåerna från i denna studie.

Våra resultat indikerar att exponering av gentamicin 24 timmar inte resulterade i försämrad ureterisk förgrening eller förändrat uttryck av nyckelvägar. Även om vi märkte en trend mot minskad ureterisk förgrening var denna skillnad inte statistiskt signifikant. Detta motsäger tidigare resultat från Gilbert et al . som fann minskad ureterisk förgrening i råttorgankulturer med en gentamicinkoncentration av 100 | imol / l (7). Den huvudsakliga skillnaden mellan våra tillvägagångssätt kan hittas i djurarter (råtta mot möss i den aktuella studien) och i utvecklingsstadiet. Vi tror att skillnaden i arter är troligen av sekundär betydelse för utvecklingsstadiet eftersom effekter av exponering för utero gentamicin på njurutveckling rapporterades både hos råttor, möss och marsvin (3, 4, 5, 6, 7, 18). Även om vissa skillnader i mottaglighet kan vara närvarande. Jämförelse av Theiler och Witschi utvecklingsstadier (19), våra E13-möss är ungefär 12–24 timmar mer mogna jämfört med E14 råttaembryon. Det är välkänt att tidpunkten för förolämpningar under organutveckling är av stor betydelse för resultatet och att dosering på en dag senare helt kan avskaffa alla effekter (20). Med hänsyn till dessa faktorer har gentamicin potentialen att störa nefrogenen, men det kliniska dosområdet tycktes vara säkert när det administrerades inom den tidsram och de arter som vi studerade.

Från uppgifterna från våra valda potentiella alternativ drar vi slutsatsen att ceftazidim inte verkar vara ett bra substitut för gentamicin. I högdosgruppen identifierades en nedsatt njurutveckling och nedreglering i motsvarande vägar.

Vi antar att ceftazidim påverkar njurprogenitorcellpopulationen och orsakar nedreglering av Fgf8 och efterföljande nedreglering av Gdnf vilket resulterar i ureterisk knoppsvikt. Fgf8 är viktigt vid överlevnad av celler i njurprogenitorceller, som är en viktig källa för Gdnf-produktion (21, 22). Däremot noterades inga uttrycksförändringar i Bmp7 , som också är lokaliserad till progenitorcellpopulationen (23), vilket antyder ingen generell progenitorcellförlust med möjligen cellförlust i en specifik underpopulation. Detta fynd stöds med de normala uttrycksnivåerna för Caspase 3 och Caspase 9, markörer av apoptotiska förolämpningar och också viktiga för den normala utvecklingen av det renala tubulära nätverket (24). Alternativt kan ceftazidim direkt påverka både mesenkym och ureterisk knopp. Även om denna höga dos är tiofaldigare än vår teoretiska beräknade kliniska dos, är den faktiska intracellulära koncentrationen i humana celler okänd. Baserat på våra resultat bör säkerheten för ceftazidim för behandling av gravida kvinnor omprövas, eftersom det kan vara skadligt för tidigt njurutveckling av fostret. Dessutom rapporterades tidigare om ceftriaxon att ha en negativ effekt på nefrogenes hos råttor (25), vilket understryker de allmänna potentiella skadliga effekterna av maternals cefalosporinanvändning på fetalt nefrogenes.

I motsats härtill visade meropenem ingen negativ effekt på ureterisk knoppgrening eller mRNA-nivåer av viktiga utvecklingsvägar, och kan därför vara en potentiellt användbar substitution för gentamicin med avseende på nefrogenes.

Våra studier har vissa begränsningar. Först, på grund av utvecklingsstadiet och metoden för antikroppfärgning, kan vi för närvarande inte utvärdera ureterisk knoppfärgning utöver 24 timmar exponering. Därför kan det vara så att långvarig exponering för gentamicin eller meropenem så småningom resulterar i njurskador. Att använda genetiskt modifierade möss med intrinsiskt fluorescerande proteinuttryck i ureterknoppen kan lösa detta problem och möjliggöra sådana längre studier (16). För det andra har vi inga uppgifter om läkemedelsupptag i cellerna. Gentamicin har visats vara påvisbart i embryonala njurceller efter 8 timmars exponering (7). Vår ex vivo- modell är något mogenare och av en annan art som kan påverka upptag. Vi noterade dock en dosrelaterad trend i våra experiment och är därför övertygade om att vi hade upptag av gentamicin i vår modell. För ceftazidim och meropenem finns data ännu inte om upptag i organkultur, vilket kan spela en roll i frånvaro av effekter i den meropenembehandlade metanephroi. Emellertid antyder den reducerade bildningen av ureteriska knoppspetsar i den höga dosen ceftazidimgruppen upptag av ceftazidim av metanephros inom timmar. Dessutom undersökte vi ett urval av mål i nefrogenesvägarna och studerade genuttryck snarare än proteinuttryck. Ett immunohistokemiskt tillvägagångssätt försökte, men har inte gett ytterligare insikt hittills. Förutom de tekniska svårigheterna med att studera proteinuttrycksnivåer i små vävnader som metanephroi, anser vi att den betydande morfologiska förändringen i dessa odlade metanephroi visar relevansen av de förändrade genuttrycksnivåerna. För att studera apoptos beslutade vi att studera mRNA-nivåer av 2 olika caspaser. Alternativt kan TUNEL användas i samma utsträckning och bör utföras i framtida studier. Slutligen, för närvarande har vi inte data om olika tidpunkter under utveckling där njurarna kan vara mer utsatta för specifika läkemedel. Detta skulle vara ett mycket viktigt framtida steg för att relatera studieresultat till mänsklig embryonal njureutveckling.

Vårt mål var att bestämma huruvida dessa antibiotikaföreningar kan störa en basal utvecklingsprocess som ureterisk knoppdifferentiering när de administreras i ett kliniskt dosintervall. Baserat på våra data kan vi dra slutsatsen att kortvarig gentamicin- eller meropenembehandling i detta stadium av embryonal njurutveckling inte har någon negativ inverkan på nefrogenen. Emellertid visades ceftazidim hämma ureterisk förgrening och uttrycket av Fgf8 och Gdnf , två viktiga aktörer i njurutvecklingen. Vidare bör tillväxt av metanefrisk ytarea inte användas som en utvecklingsprediktor för njurarna, men ytan vid explantation kan användas för att korrigera för variationer mellan och mellan kull i utvecklingsstadier.

metoder

Narkotika

Gentamicin (G1272) och ceftazidimhydrat (C3809) erhölls från Sigma-Aldrich (Zwijndrecht, Nederländerna). Meropenem erhölls från Fresenius Kabi (Teramo, Italien).

Orgelkultur

Experiment godkändes av djuretikkommittén vid Radbouduniversitetet Nijmegen. Embryonal dag 13 gravid HSD: ICR-honmöss (Harlan, Horst, Nederländerna) avlivades efter ankomst genom cervikal dislokation och njurarna dissekerades från embryona med hjälp av två små nålar. Intakt isolerade metanephroi hölls på is i förkylt Leibovitz-medium (Gibco, Paisley, UK) tills överföring till organkultursystemet. Metanephroi odlades på 0, 4 pm porstorlek Millicell-cellodlingsinsatser (Millipore, Carrigtwohill, Irland) placerade i en sex-brunnars platta innehållande DMEM / F-12 (1: 1) medium (Gibco), kompletterat med 10 mg / l insulin, 5, 5 mg / l transferrin och 5 ug / l natriumselenit (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Beroende på behandling tillsattes läkemedel till mediet och metanephroi inkuberades vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 timmar. För gentamicin valdes läkemedelskoncentrationer av 3, 30 och 300 umol / l. Ceftazidim och meropenem testades båda vid 20, 200 och 2 000 umol / l. Koncentrationsnivåer beräknades enligt följande: Den kliniska pediatriska doseringen användes och korrigerades för plasmabindning och distributionsvolym enligt tabell 1 (26, 27, 28, 29, 30, 31, 32). Dessutom studerades koncentrationer med en faktor 10 ovan och nedan för att ta hänsyn till beräknings osäkerheter och för att undersöka ett potentiellt dosresponsförhållande.

Full storlek bord

Alla metanephroi från ett kull tilldelades slumpmässigt till en av behandlingsgrupperna och en separat grupp utan behandling som bestod av metanephroi från samma kull inkluderades för varje läkemedel. Per kull undersöktes ett läkemedel för att utesluta skillnader på grund av variationen mellan kullarna. Flera kullar studerades per läkemedel.

Metanefrisk tillväxt

Tillväxten av de explanterade metanephroi bestämdes genom att mäta ytområdets expansion på 24 timmar. Fotografier av metanephroi erhölls med en Canon EOS 1000D-kamera (Canon, 's Hertogenbosch, Nederländerna) ansluten till ett Zeiss Axiovert 25-mikroskop (Carl Zeiss, Sliedrecht, Nederländerna) med en total förstoring på 12, 5 ×. Bakgrundsbelysningen inställdes på maximal intensitet och en slutartid på 40 ms användes. Fotografierna togs med en upplösning på 10, 1 megapixlar och ytareastorleken analyserades med FIJI / ImageJA version 1.45i (33).

Ureteric Tip Imaging

Immunfärgning av helmontering av metanephroi utfördes för att visualisera det ureteriska trädet efter 24 timmars kultur. Metanephroi fixerades i iskall metanol under 10 minuter och tvättades med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 15 minuter. Därefter inkuberades metanephroi i PBS innehållande 2% bovint serumalbumin under 12 timmar för att blockera icke-specifik bindning. Efter tvättning med PBS innehållande 1% Triton X-100 (PBS-T) inkuberades metanephroi med en antikropp mot calbindin-D28k (Sigma Aldrich), utspädd 1: 100 i PBS-T, under 24 timmar. Återigen efter tvättning med PBS-T utfördes inkubering med en Alexa 488 IgG-antikropp (Invitrogen, Eugene, OR) vid en utspädning av 1: 300 i PBS innehållande 2% bovint serumalbumin under 24 timmar. All inkubation och tvättsteg utfördes vid 4 ° C. Efter ett sista tvättsteg i PBS-T på 15 minuter monterades metanephroi på ett objektglas i monteringsmedium (Dako, Carpinteria, CA) och förseglades med användning av paraffin.

För varje metanephros visualiserades ureterisk förgrening genom konfokal laserscanningsmikroskopi med användning av ett Leica TCS SP2 mikroskop. Optisk snittning utfördes med ett intervall på 4 um vid en förstoring av 10 x. Per metanephros förvärvades mellan 18 och 30 bilder med en upplösning av 1 024 × 1 024 pixlar. Därefter räknades mängden ureteriska spetsar med multipoint-verktyget i FIJI. En spets definierades som en slutpunkt för hela grenstrukturen som inte visade några tecken på förgrening.

Genuttrycksanalys

RNA isolerades från metanephroi genom att kombinera Trizol-extraktionsmetoden med NucleoSpin RNA II-isoleringssatsen (Machery-Nagel, Düren, Tyskland). Metanephroi suspenderades i Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) och inkuberades under cirka 30 minuter med enstaka virvelbildning. Efter tillsats av kloroform (Merck) inkuberades proverna på is under 5 minuter och centrifugerades vid 14 000 g , 4 ° C under 15 minuter. Vattenfasen tillsattes 1: 1 till 70% etanol för att justera bindningsbetingelser och laddades på Nucleospin-kolonnen. Ytterligare rening utfördes enligt tillverkarens protokoll. RNA-koncentration och kvalitet bedömdes med Nanodrop 2000c-spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

Komplementärt DNA genererades på en Biozym MJ Research PTC-200 Peltier termisk cykler med användning av slumpmässiga primrar (Promega, Madison, WI), oligo dT (Promega) och M-MLV omvänt transkriptas (Invitrogen). mRNA-nivåer av Wtl , Sox9 , Bmp7 , Fgf8 , Gdnf , Casp3 och Casp9 mättes med kvantitativ PCR (qPCR) med Actb och Hmbs som interna standarder.

qPCR utfördes på en Biorad CFX96 med användning av genuttrycksblandningen och hydrolysprober ( tabell 2 ) enligt beställning från Applied Biosystems (Pleasanton, CA). Delta-delta CT-värden undersöktes och en upp- eller nedreglering av faktor 2 ansågs vara biologiskt relevant.

Full storlek bord

Statistik

Metanefrisk ytutvidgning vid 24 timmar och metanefrisk ytarea vid explantation undersöktes båda för korrelation med ureterisk knoppspetsutveckling och testades med en Pearsons korrelationskoefficient.

Jämförelse av ureterisk knopputveckling för varje behandling undersöktes med envägsanalys av varians följt med Dunnett som post hoc . För båda analyserna undersöktes statistisk signifikans på a = 0, 05-nivån.

Uttalande om ekonomiskt stöd

Detta projekt stöds av ett Kolff-bidrag till MFS (KJPB.08.06) från Dutch Kidney Foundation, Bussum, Nederländerna.

Offentliggörande: Det finns ingen intressekonflikt att avslöja.