En integrerad statistisk modell för förbättrad muskardiomyocytdifferentiering via optimerat engagemang av extracellulära matriser 3d | vetenskapliga rapporter

En integrerad statistisk modell för förbättrad muskardiomyocytdifferentiering via optimerat engagemang av extracellulära matriser 3d | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Biomedicinsk forskning
  • Framkallade pluripotenta stamceller

Abstrakt

Den extracellulära matrisen (ECM) påverkar stamcelldifferentiering, men att identifiera formuleringar som stöder differentiering är utmanande i 3D-modeller. Tidigare ansträngningar med kombinerande ECM-matriser verkade intuitivt fördelaktiga. Vi föreslår ett alternativ som föreslår att provstorlek och teknisk börda minskar kan vara fördelaktigt och tillgängligt när det är kopplat till design av experimentmetoder. Vi förutspår att optimerade ECM-formuleringar kan öka differentieringen av kardiomyocyter härledda in vitro . Vi använde nativ kemisk ligering för att polymerisera 3D-poly (etylenglykol) hydrogeler under milda förhållanden medan vi fångade olika kombinationer av ECM och murininducerade pluripotenta stamceller. Systematisk optimering för kardiomyocytdifferentiering gav en förutsagd lösning av 61%, 24% och 15% av kollagen typ I, laminin-111 respektive fibronektin. Denna lösning bekräftades av ökat antal hjärt troponin T, a-myosin tung kedja och a-sarkomär aktinin-uttryckande celler relativt suboptimala lösningar. Kardiomyocyter av kompositer uppvisade connexin43-uttryck, lämplig kontraktil kinetik och intracellulär kalciumhantering. Tillägg till en modulator av vidhäftning, trombospondin-1, upphävnad kardiomyocytdifferentiering. Således identifierade den integrerade biomaterialplattformen statistiskt en ECM-formulering som bäst stödjer kardiomyocytdifferentiering. I framtiden kan denna formulering kopplas till biokemisk stimulering för att förbättra funktionell mognad av kardiomyocyter härledda in vitro eller transplanterade in vivo .

Introduktion

Differentiering av stamceller till specifika linjer under utvecklingen regleras tätt av den lokala mikromiljön inklusive tillväxtfaktorer, extracellular matrix (ECM) proteiner och omgivande celler över tiden 1, 2 . Stamceller som tas utanför kroppen är på samma sätt beroende av mikromiljön och de senaste två decennierna har man sett en ökad kunskap och motsvarande teknik för att bäst manipulera stamcellstillstånd i en kulturdisk 2 . Hittills är det primära fokuset manipulering av tillväxtfaktor och leverans av små molekyler 3, 4 . Framstegen inom detta område har katalyserats av förbättrad förståelse för de genetiska händelserna som orsakar specifikation och de lösliga faktorerna som kan stimulera dessa genetiska händelser. Dessutom är det tekniskt enkelt att lägga till lösliga komponenter till ett 2D-odlingssystem. Mer utmanande är identifiering och presentation av flera olösliga komponenter, nämligen ECM-proteiner, i 3D.

Differentiering av de flesta celltyper skulle gynnas av identifieringen av definierade ECM-formuleringar för att förbättra specifikationen. Kardiomyocytdifferentiering är ett spännande testfall. Exogena ECM-proteiner krävs både för att främja överlevnad av kardiomyocyter ex vivo 5 och för att implementera alla kardiomyocytdifferentieringsprotokoll som använts hittills 2 . Medan de lösliga komponenterna som krävs för att driva kardiomyocytdifferentiering har blivit mer väl definierade (dvs. eliminering av FBS och tillsats av MAPK-hämmare, PGI2, BMP2 / 4, Activin A, bFGF, Wnt3a, B27), är sammansättningen av exogen ECM (dvs. matrigel eller ECM från matarceller) är i stort sett okänd. Dessutom har stamcell-härledda kardiomyocyter in vitro för närvarande inte möjlighet att återkapitulera alla funktionella egenskaper hos mogna kardiomyocyter in vivo 1 . Funktionen som oftast saknas är kontraktilitet, en karakteristik som definitivt är knuten till kopplingen av cellcytoskelett med ECM 6, 7, 8 . Följaktligen hjälper ECM säkert kardiomyocytets specifikation, men huruvida den maximala effekten av ECM i detta sammanhang har uppnåtts i en kulturdisk är oklart.

Tidigare arbete utvecklade och använde metoder för att testa påverkan av flera ECM-formuleringar på (stam) cellbeteende. Först utvecklades en ECM-mikroarrayplattform där 2D kombinerande matriser kunde upptäckas på en bild och ympas med celler. ECM deponerades med 32 olika kombinationer av 5 olika ECM-molekyler för att identifiera kombinationer av ECM som synergistiskt påverkar hepatocytfunktion och embryonala stamcellsdifferentiering 9 . Några år senare förstärktes samma gruppkoncept för att inkludera parvisa kombinationer av 38 unika ECM för totalt 768 olika kombinationer för att visa att fibronektin i kombination med galectiner-3 och -8 underlättar vidhäftning och metastaserande progression av lungcancerceller 10 . Sedan dess har ansträngningar gjorts för att utnyttja 3D-modellsystem för att närma sig vävnadsliknande scenario. I synnerhet har metakrylerat gelatin 11 och poly (etylenglykol) (PEG) 12 använts som basmaterial för att införliva diskreta ECM-kombinationer med celler för att förändra mesenkymal stamcell och embryonal stamcellsbeteende. Resultatet i dessa fall realiseras med mer detaljerade analyser inklusive huvudkomponent- eller nätverksanalys.

Medan fler kombinationer och högre genomströmning verkar vara intuitivt fördelaktiga, betraktar vi några av de inneboende begränsningarna. För det första finns det tekniska utmaningar och specialutrustning förknippad med hög genomströmning som gör att strategin är otillgänglig för många laboratorier. För det andra, även när tekniken finns tillgänglig, lämpar sig multiplexer och små volymprover till utmaningar med variabel mellan prov och prov. Ännu viktigare är statistiska tillvägagångssätt som använts för att analysera mikroarray-data hittills typiskt kombinatoriska täckande diskreta nivåer och definieras endast inom de testade områdena i experiment. Denna analysregim kan inte leda till förutsägelsemodeller baserade på olika input.

Vi föreslår ett alternativ som föreslår att provstorleken minskar och den tekniska bördan kan vara fördelaktigt, särskilt när det är kopplat till en statistisk strategi för design av experiment (DoE). Vårt laboratorium har utvecklat en strategi som kombinerar en fysisk kulturplattform med en statistisk analysregime för att optimera differentieringen av murina iPSC: er till kardiomyocyter. I synnerhet använder vi nativ kemisk ligering (NCL) 13 för att polymerisera 3D-PEG-hydrogeler i vattenhaltiga och milda miljöer utan att använda initiatorer eller UV-ljus. Eftersom NCL-polymerisationen fortskrider kemoselektivt mellan de två föregångarna (PEG-Cys och PEG-tioester, fig. 1a), kan en mängd olika ECM-komponenter och celler lätt fångas in och interaktionen av celler med ECM i detta sammanhang är avgjort 3D i sin natur 14, 15 . Metodens kemoselektiva natur möjliggör också exakt kontroll av olika kombinationer av olösliga proteiner i 3D samtidigt som mekaniska egenskaper bibehålls. Vid upprättandet av denna biomaterialplattform använde vi DoE-strategier för att identifiera huvudeffekter och tillhörande interaktioner som bidrar till kardiomyocytdifferentiering, bestämd genom uttryck av hjärt troponin T (cTnT) (Fig. 1b). Information som erhölls vid detta steg optimerades med tillnärmning av icke-linjära modeller, som identifierade en uppsättning potentiella lösningar från ett formuleringsutrymme som inte begränsades av den diskreta uppsättningen experimentprover. Även om DoE-tillvägagångssätt har utförts i stor utsträckning inom teknik och farmaceutisk teknik 16, 17, har kombination av modulära biomaterialplattformar och denna statistiska metod uppskattats nyligen 12, 18, 19 . Med detta tillvägagångssätt fann vi en formulering av multi-ECM-matriser som inkluderade kollagen typ I, laminin-111 och fibronektin, som väsentligt främjade differentieringen av murina iPSC: er (miPSC) till cTnT-uttryckande fenotyper utan tillsats av lösliga faktorer på 21 dagar av kultur (fig. 1c).

Image

( a ) Schematisk representation som visar produktion av ECM-kompositer inklusive flera olika ECM-proteiner vid olika koncentrationer med enstaka iPS-celler via NCL från PEG-prekursorer (tioester eller Cys). Vi använder tre olika ECM-proteiner som representerar fibrillar kollagen typ I, källarmembranlaminin-111 och cell-ECM-kopplande fibronektin, men en större variation är tekniskt genomförbar. ( b ) Statistisk optimering av flera ECM-proteiner kan maximera uttrycket av cTnT med RSM, vilket ger en uppsättning potentiellt optimala lösningar. ( c ) Den optimala formuleringen valideras genom att mäta förbättringen av cTnT-uttryck och funktionaliteten hos kardiomyocyter genom att avbilda kontraktilkinetik och Ca2 + -transienter.

Bild i full storlek

Resultat

FE för att definiera formuleringen för ECM-driven kardiomyocytdifferentiering i 3D

Det första steget i DoE-metoden kallas factorial experiment (FEs), varvid varje faktor är inställd på två olika nivåer för ett givet definierat svar. I vårt fall var FE-faktorerna kollagen typ I (Col I), laminin-111 (LN) och fibronektin (FN) som skulle införlivas i PEG-ECM-kompositer (fig. 1) och de två nivåerna sattes till 0 mg / ml (låg eller -) och 0, 83 mg / ml (hög eller +), som sträckte sig från 0 till 2, 5 mg / ml av den totala ECM-koncentrationen i ECM-kompositer (tabell 1). Dessa koncentrationer valdes av både praktiska och biologiskt motiverade skäl. Först fann vi mekanisk styvhet hos hydrogeln förblev oförändrad med upp till 2, 5 mg / ml protein vid ungefär 0, 9 kPa (Kompletterande Fig S1). Styvheten motsvarar det tidiga embryonala hjärtat 20, 21, som vi resonerade skulle kunna stödja differentiering av (mi) PSC: er bättre än styvare eller vuxenliknande mekaniska miljöer. I princip kan alltså observerade förändringar i differentieringsbeteende till stor del tillskrivas den biokemiska sammansättningen av ECM i motsats till de mekaniska egenskaperna hos 3D-ställningen. Dessutom används dessa tre huvudeffekter (Col I, LN och FN) rutinmässigt men varierbart för kardiomyocytdifferentieringsprotokoll och finns i stora volymfraktioner i vuxna och utvecklande hjärta 22 . Slutligen fann vi att koncentrationer av ECM som användes i 2D-kultur 23, 24 (som extrapolerat för 3D-volymutrymmet) skulle inkluderas i den resulterande formuleringen. Eftersom vi antagit att svaren inte skulle vara linjära när varje faktor ändrades från 0 mg / ml (låg eller -) till 0, 83 mg / ml (hög eller +) i FE, tillsattes en mittpunktformulering (000 i tabell 1) . Svaren definierades initialt som antingen uttryckta proteiner som indikerar kardiomyocytdifferentiering (cTnT) eller motsvarande genuttryck (Tnnt2).

Full storlek bord

FE analyserades upp till interaktioner med tredje ordningen med alla tre ECM-proteinerna för båda responserna (cTnT respektive Tnnt2, svar 1 respektive 2). Konventionellt kan svaren plottas som ett stapeldiagram (fig. 2a). Det är logiskt att dra slutsatsen att flera ECM-proteiner ökar populationen av cTnT-uttryckande miPSC och därför kardiomyocytdifferentiering. Men med denna enkla analys är det mycket utmanande att skilja graden av påverkan på cTnT-uttryck från enskilda ECM (dvs. huvudeffekten) eller variationen av huvudeffekter modifierade av andra huvudeffekter (dvs. 2-vägs eller 3- sätt interaktioner). Från ANOVA Tukey's post hoc- test identifierades endast tre formuleringar för att vara signifikant olika (Fig. 2a). Men genom att utvärdera parameteruppskattningar associerade med DoE-analyser uppstår flera huvudeffekter och interaktioner (Fig. 2b). Col I och LN var signifikanta huvudeffekter för att maximera cTnT-uttryck och FN var positiva i mindre signifikant utsträckning. Parameteruppskattningarna visade att när Col I ändrades från 0 (låg eller -) till 0, 83 mg / ml (hög eller +), förbättrades cTnT-uttrycket med 0, 103. Detta resultat betyder att areafraktionen av cTnT-uttryckande miPSC kommer att ökas med 0, 103 när Col I ökas från 0 till 0, 83 mg / ml. På samma sätt förbättrar tillägg av LN areafraktionen av cTnT-uttryckande celler med 0, 084. FN var en positiv huvudeffekt i mindre grad av betydelse för att maximera cTnT-uttryck från miPSC. Eftersom alla interaktionseffekter låg under rimliga signifikansnivåer i intervallen i FE, diagramde vi interaktionerna i konturplott (fig. 2c) för att samla ytterligare detaljer. Interaktioner mellan två ECM: er visade att koncentrationer kring centrumpunkten 000 (0, 42 mg / ml) var mest synergistiska. De högre interaktioner mellan Col I och LN indikerades utanför de övre gränserna (0, 83 mg / ml) för Col I och LN. Som ett resultat, och såsom beskrivs nedan, ökades koncentrationerna (nivåerna) för Col I och LN därefter till 1, 04 mg / ml, vilket systematiskt ökades ovanpå de nivåer som utforskades i FEs.

Image

( a ) Ett enkelt diagram visar att flera ECM-proteiner (detaljerade formuleringar i tabell 1) främjade uttrycket av cTnT, jämfört med ingen ECM (−−−) eller enstaka ECM (+ −−, - + - eller −− +) . ( b ) Effektstorlekar av alla huvudeffekter och interaktioner för uttryck av cTnT (protein). Blå linjer indikerar signifikanta sannolikhetsvärden på 0, 05. ( c ) Konturdiagram som visar interaktioner mellan FN och Col I, LN och Col I, och FN och LN. ( d ) ECM-kompositer som avgränsades i tabell 1 testades också för expression av Tnnt2 (gen). Resultat i ( a, d ), ANOVA Tukey's HSD post hoc- test, n = 3, * p <0, 05, medelvärde ± SD

Bild i full storlek

Förutom uttrycket av cTnT som en indikator på mogna kardiomyocyter undersöktes RNA-uttryck av hjärt troponin T (Tnnt2) med realtids kvantitativ PCR (qRT-PCR) och betraktades som "svar 2". RNA extraherades från hela ECM-kompositen och kopienummer normaliserades till Gapdh för varje ECM-komposit (fig. 2d). Parametrar var alla negativa för att förbättra Tnnt2-uttryck förutom den andra ordningens interaktion från LN och FN (LN × FN) (Kompletterande Fig S3). Intressant nog var både LN och FN negativa och signifikanta huvudeffekter för att maximera Tnnt2-uttrycket. Med tanke på den slående skillnaden i resulterande parametrar jämfört med cTnT-proteinuttryck undersökte vi litteraturen för bevis på Tnnt2-transkriptdynamik med utveckling och med ackumulerat cTnT-protein i cellen. Vi fann, uttryck av Tnnt2 (gen) toppar vid postnatal dagar 8-10 med den efterföljande minskningen av uttrycket fram till vecka 24 av fostrets utveckling 25, 26, 27, 28 . Denna dynamik är ganska intressant men gör statistisk tolkning ganska komplicerad relativt den kontinuerligt ökande (till maximala) naturen av cTnT-proteinuttryck. Av detta skäl var det kardiomyogena svaret från miPSC till ECM-kompositer begränsat till cTnT-uttryck (svar 1) för alla ytterligare experiment.

Följaktligen användes FEs där huvudeffekter sattes till att sträcka sig från de lägsta till högsta möjliga koncentrationerna av ECM-proteiner i en definierad PEG-hydrogel tvärbunden med en kemoselektiv kemi. Med hjälp av en enkel stapeldiagram med ANOVA sågs huvudeffekterna och interaktioner med högre ordning inte lätt. Däremot identifierade FE inte bara den betydande huvudeffekten och interaktioner mellan ECM-proteiner, utan också omfattningen av de för att maximera våra avsedda svar, uttrycket av cTnT.

Svarsytregression för att finslipa de optimala ECM-formuleringarna för kardiomyocytdifferentiering i 3D

I FEs togs cTnT-uttryck (svar) vid två olika nivåer (låg eller -, 0 mg / ml och hög eller +, 0, 83 mg / ml) för varje faktor (ECM-protein). Formuleringar innehållande mer än två ECM-proteiner förbättrade signifikant uttrycket av cTnT, vilket indikerar att varje ECM bidrog till att förbättra uttrycket av cTnT på synergistiska eller additiva sätt (fig. 2). För att nå en uppsättning potentiella lösningar för att maximera cTnT-uttrycket (respons), flyttade vi till optimeringen med DoE-strategier som möjliggjorde utforskning av det intressanta området genom att förstärka ytterligare nivåer ovanpå FE, kallad central kompositdesign (CCD) . Fördelarna med CCD är att inga antaganden behöver göras beträffande nivåerna av faktorer (eller strukturer för faktorerna), vilket gör att man kan analysera någon uppsättning kontinuerliga värden för faktorerna 16, 17 . I motsats till att testa flera diskreta nivåer och generera data av arraytyp, leder denna metod till en uppsättning förutsagda huvudeffekter från en icke-linjär kontinuerlig funktion, nämligen en "svaryta" i ekvation (1). I industriella tillämpningar är typiska kvadratiska komponenter tillräckliga för att belysa det krökta förhållandet mellan faktorer och svar, vilket ger en allmän modellekvation ( svar- ytregression) med k- faktorer:

Image

Efter designprincipen för att skapa CCD med faktorerna (Col I, LN och FN) och svaret (cTnT-uttryck) skapades ytterligare nivåer (koncentrationer) som axiellt högt (A, 1, 04 mg / ml för Col I eller LN) eller axiell låg (a, 0 mg / ml för Col I eller LN) motsvarande de högsta och lägsta nivåerna för Col I respektive LN (tabell 2). Nivåerna ökades ovanpå de tidigare FE: erna (tabell 1) och spridda över det potentiella formuleringsutrymmet. Även om nivåerna för Col I och LN utvidgades för att gå utöver vad som testades i FE, behövdes FN: s roll att fokuseras om FE: s centrum (000). Följaktligen reducerades den högsta nivån av FN till 0, 42 mg / ml.

Full storlek bord

Från experimentella körningar med RSM (tabell 2) var alla ECM-proteiner positiva för att maximera cTnT-uttryck med varierande omfattning (fig. 3a). LN var den mest betydande huvudeffekten medan Col I och FN var mindre signifikanta. Alla interaktioner med andra ordningen identifierades negativa, men graden av omfattning var varierande och obetydlig för att maximera cTnT-uttrycket. Även om detta kunde leda till spekulationer om deras antagonistiska bidrag, var de andra ordningens interaktioner inte förenklade linjära såsom visas i fig. 3b. FN visade det högsta svaret runt det maximala (0, 42 mg / ml; axiell hög A för FN), medan interaktionen mellan FN med antingen Col I eller LN identifierades positivt när koncentrationen av Col I eller LN ökade (fig. 3b). Omfattningen av FN-interaktioner med andra ECM varierar i bredare intervall antingen synergistiska 29 eller antagonistiska 10, också beroende på hur FN presenteras för celler (2D kontra 3D). LN nådde ett platånivåsvar över mellanområdet i sin interaktion med Col I (fig. 3b), vilket indikerade att LN redan nådde ett asymptotiskt värde för cTnT-uttryck. Ökningen av Col I förstärkte uttrycket av cTnT i allmänhet i hela intervallet med antingen LN eller FN. Den andra ordningens interaktioner med samma huvudeffekt (Col I × Col I, LN × LN och FN × FN) visar lutningen för svarsytan. Matrisnotationen för svarsytan är detaljerad i kompletterande tabeller S1–3. Formen på egenstrukturen definierades från matrisen för alla andra ordningens uppskattningar (Fig. 3a). I den första raden i den kanoniska krökningstabellen (tilläggstabell S2) var egenvärdena för Col I, LN och FN 0, 0617, 0, 0138 och −0, 0494, vilket indikerar svarsytan för Col I och LN kurvor upp från ett lokalt minimum och FN gör det motsatta från ett lokalt maximum. Från dessa blandade egenvärden är svarsytan sadelformad, där den förutsagda lösningen med maximalt cTnT-uttryck var 1, 15, 0, 45 respektive 0, 28 mg / ml Col I, LN respektive FN (kompletterande tabell S3). Vi validerade den förutsagda lösningen på tre olika sätt genom 1) bedöma uttrycket av sarkomära proteiner från celler i ECM-kompositer framställda med användning av den förutsagda lösningen, 2) utvärdera kontraktil kinetik och intracellulära Ca 2 + -transienter av ECM-komposit-härledda kardiomyocyter och 3) förändring ECM-innehåll i kompositer med en vidhäftningsmodulator med påverkan på kardiomyogenes.

Image

( a ) Effektstorlekar av alla huvudeffekter och interaktioner med två faktorer för att passa regressioner på svarytan. Blå linjer indikerar signifikanta sannolikhetsvärden på 0, 05. (b) Konturdiagram som visar interaktioner mellan FN och Col I, LN och Col I, och FN och LN från RSM, vilka skiljer sig från FE i fig 2c och indikerar olika intervall testade i RSM.

Bild i full storlek

Modellvalidering 1: Bekräftelse av resultaten härledda från RSM

Vi testade om den statistiska optimeringen verkligen var den "optimala" formuleringen för att förbättra uttrycket av cTnT. En suboptimal formulering (+++) från RSM och ingen ECM-kontroll (PEG) inkluderades (kompletterande tabell 4). Vi fann att den optimala formuleringen förbättrade uttrycket av cTnT signifikant över dess primära utmanare, gruppen +++ (fig. 4a) med den genomsnittliga procenttalet av celler som uttrycker cTnT som översteg 35%. Vi observerade också förbättringen av aMHC (a-myosin tung kedja, fig. 4b) och aSA (a-sarkomiskt aktinin, fig. 4c) proteinuttryck från den optimala formuleringen. Förutom att kvantifiera sarkomära proteiner uppvisade celler i ECM-kompositer med den optimala formuleringen betydande Cx43 (connexin43) -positiv färgning (fig. 4d), som stödjer direkt elektrisk koppling av kardiomyocyter differentierade med användning av detta integrerade biomaterial och statistiska plattform.

Image

Förbättring av cTnT ( a ) aMHC ( b ) och aSA ( c ) -uttryck testades med experimentella (opt) och kontrollgrupper (PEG och +++, formuleringar i kompletterande tabell 4). ( d ) Expression av Cx43 visualiserades med MPLSM i 3D ECM-kompositer. ANOVA Fishers LSD post hoc- test, n = 7 ( a ) eller n = 3 (b eller c) ** p <0, 01 och * p <0, 05, medelvärde ± SD Den högre och mörkare gradientkilen indikerar högre koncentrationer eller antal ECM-proteiner associerade i formuleringen.

Bild i full storlek

Modellvalidering 2: Bedömning av kontraktil kinetik och avbildning av intracellulära Ca 2 + -transienter av kardiomyocyter

För att komplettera den fenotypiska profileringen av sarkomära proteiner använde vi hög bildhastighet (> 150 bilder per sekund) DIC-avbildning 30 och konfokal avbildning av slagområden av ECM-kompositer. Metodik med hög ramfrekvens kvantitativt bedömd kontraktil kinetik via statistisk analys av filmer av kontraherande kardiomyocyter där förändringar i cellulär morfologi över tid används för att beräkna kontraktil kinetik. Spontant kontraherande kardiomyocyter odlade i PEG-geler uppvisade markant reducerad kontraktilitet med endast sällsynta celler som uppnådde förkortning av 3%. Däremot uppvisade celler som odlades i optimerade kompositer rutinmässigt förkortningar på 6–7%. Dessutom var förkortningshastigheten signifikant högre i den optimerade formuleringen relativt ingen ECM (PEG, p < 0, 05). För att visualisera excitation-kontraktionskoppling av kardiomyocyter, använde vi fluorescerande Ca 2+ -indikatorer och konfokala avbildningstekniker, som gav de mest mångsidiga och allmänt använda metoderna för analys av cellulära Ca 2+ -svar för olika typer av celler inklusive differentierade PSC: er till kardiomyocyter 31, 32 . Kardiomyocyter differentierade under 7 dagar i EB och mognades under 3 dagar bundna till en odlingsskål användes som en positiv kontroll (Kompletterande Fig S4). Kvalitativ analys av 30-tals spår avslöjar uppenbara skillnader i Ca 2+ -hantering mellan grupperna (Fig. 5b; Kompletterande videor 1-3). Kvantitativ analys av interspike-intervaller (ISI) för optimal formulering (1, 25 ± 0, 35) visade en signifikant ökning av ISI relativt ingen ECM (PEG, 0, 56 ± 0, 19) kontroll och en ökning i förhållande till formuleringen +++ (0, 86 ± 0, 47) (Tilläggsfigur S4a). PEG och +++ visade relativt snabb och sporadisk svängning av fluorescensintensitet (F) medan den optimala formuleringen och EB-kontrollen visade snabb tid till topp och långsam, enhetlig förfall. Observera att vi inte gör en jämförelse mellan den optimala formuleringen och EB-kontrollerna eftersom karaktären av signalutbredning i 3D mot 2D är helt annorlunda. Denna kontroll användes helt enkelt som ett medel för att samla in en känd positiv signal. Den relativa maximala intensiteten för den fluorescerande Ca 2+ -indikatorn (Fluo-4 AM) jämfördes också (kompletterande fig. S4b). Maximala F / Fo-förhållanden var relativt konstanta mellan grupper i spontant sammandragande kompositer.

Image

( a )% klusterlängd utvärderades genom användning av hög bildfrekvens DIC. Representativ kontraktilitet från ECM-kompositer. ( b ) Fluo-4 AM (Ca 2+ indikator) intensitet (F) normaliserades till baslinjefluorescensen (FO). Representativ lokal Ca 2+ transient från ECM-kompositer. ( c ) Effektstorlekar av alla huvudeffekter och interaktioner för expression av cTnT (protein) med Col I, FN och TSP1 (formuleringar i tabell 3).

Bild i full storlek

Modellvalidering 3: Utvärdering av trombospondin (TSP1), en vidhäftningsmodulator, vid kardiomyocytdifferentiering

För att ytterligare validera den förutsagda lösningen integrerade vi TSP1 i vår integrerade statistiska modell. Det har visat sig att TSP1 minskar cellvidhäftningen i hjärtat, särskilt i samband med patologi eller ärrbildning snarare än förnyelse 33 . I detta valideringssteg genererades samma FE med Col I, FN och TSP1 medan nivåerna (koncentrationerna) av FN och TSP1 modifierades (tabell 3). Intressant nog var inget av svaren (cTnT-uttryck) signifikant och vi observerade inga slående fenotyper under 21 dagars kultur. TSP1 bidrog inte till förbättring av cTnT-expression och närvaron av TSP1 hämmade faktiskt svaret (cTnT-expression) (Fig. 5c). Denna förändring tillskrivs inte den minskade tillväxten av miPSC i TSP1-innehållande ECM-kompositer eftersom DAPI-färgade områden var konsistenta mellan alla DoE-formuleringar (Kompletterande Fig S5).

Full storlek bord

Från dessa tre olika valideringsmetoder fann vi att den optimala formuleringen förbättrade uttrycket av cTnT, αMHC, αSA och distinkt Cx43-uttryck (validering 1) och kardiomyocyterna från den optimala formuleringen visade lämplig kontraktil kinetik och Ca 2+ -hantering (validering 2) . Dessutom upphävde införlivande av en negativ regulator av hjärtutveckling cTnT-uttryckande och slå fenotyper (validering 3).

Diskussion

Genom att integrera en ny 3D-biomaterialplattform och DoE-strategier identifierade vi en formulering av flera ECM-proteiner (Col I, LN och FN) som kan inducera betydande nivåer av differentiering av kardiomyocyter från miPSC utan tillsats av lösliga faktorer. För att utföra DoE-tillvägagångssätt skapades flera ECM-formuleringar genom att säkerställa exogent ECM i 3D-utrymme utan modifiering eller kovalent koppling till PEG-ställningen. Den kemoselektiva naturen hos NCL-tvärbindningsreaktionen möjliggjorde användning av flera ECM-proteiner i många koncentrationsintervall utan att förändra tvärbindningskemi för varje ECM. Här var endast enkel blandning av ECM-proteiner i odlingsmedium nödvändig med lämplig pH-justering till fysiologiska nivåer för att ta hänsyn till intervallet av exogena ECM-proteiner som användes och för att säkerställa cellviabilitet. Faktiskt stöder 3D ECM-kompositer tillväxten av inkapslade miPSC under flera veckor 15 . Det är också viktigt att notera att istället för att rena populationer av iPSC: er eller inkludera sorterade EB: er i 3D-geler 34, 35, inkapslades singulariserade miPSC i ECM-kompositer och odlades utan att tillsätta nämnda lösliga faktorer 2, 3, 36 . Även om själva 3D-miljön (PEG-hydrogel) var en viktig faktor för att stödja uttrycket av cTnT, var formuleringar som innehöll flera ECM betydligt bättre än inga ECM (−−−) eller enstaka ECM-formuleringar (- + - eller −− + eller + −− i fig. 2a).

För att komma fram till en optimal formulering (dvs. kritisk punkt) för multi-ECM, använde vi DoE-metodik för att undvika att testa det oändliga antalet kombinatoriska möjligheter eller utföra konventionella försök och fel. Att hitta en kritisk punkt kräver att man skapar en kontinuerlig funktion från oberoende variabler, följt av differentiering av den kontinuerliga funktionen för att hitta den punkt där sluttningen är noll. Här var de oberoende variablerna ECM-proteiner (huvudeffekt) och den kontinuerliga funktionen genererades för att innehålla huvudeffekter, interaktioner mellan huvudeffekter och krökningar, vilket gav en regressionsekvation (1). Med matrisoperationer av dessa variabler i svarsregression hittades lösningen för att maximera uttrycket av cTnT, vilket resulterade i 1, 15, 0, 45 respektive 0, 28 mg / ml Col I, LN respektive FN (ungefär, 61%, 24% och 15% av Col I, LN respektive FN). Dessa koncentrationer eller det relativa förhållandet av ECM-proteiner erhölls genom en slutpunktanalys för att främja cTnT-uttryckande celler från miPSC i ett 3D ECM-införlivat ställning under 21 dagars odling.

Våra resultat är svåra att jämföra med tidigare studier där approximation 23, 37 och kvalitativa analyser 38 användes för att identifiera det relativa innehållet i ECM som stödjer kardiomyogenes. Dessutom har de flesta ex vivo- arbeten skett i 2D in vitro- system 3, 24, 36 och det är nu klart att 2D- och 3D-odlingsregimer är ganska distinkta när det gäller integrinengagemang och tillhörande cellöverskridande signalering. Av den anledningen har vi avsiktligt fokuserat på framsteg inom fältet relaterade till 3D- in vitro- modeller eller in vivo- studier. Och även om de flesta studier är begränsade i sin kvalitativa karaktär, är några få kvantitativa studier värda att notera. Först, i en 3D in vitro ”interpenetrerande nätverk” -modell gjord av kollagen, fibronektin och laminin, fann författarna kollagenmatriser kompletterade med små mängder laminin (1, 2 mg / ml kollagen, 0, 1 mg / ml laminin) som var mest stödjande av kardiomyocytslagning 37 . Även om endast 10 formuleringar studerades och var och en var begränsade till två ECM-komponenter, överensstämmer resultaten i stort med våra. För det andra visar en in vivo- studie av ventrikulär vävnad under utveckling kvantitativ analys av flera ECM-proteiner inklusive kollagentyper I och IV (källarmembran associerat med laminin) och fibronektin 22 . Författarna jämför expression av varje ECM-komponent via immunofluorescens med utveckling (dvs från embryonal dag 12, 5 till postnatal dag 2). Det är intressant att notera att vid embryonal dag 16.5 (höjden på cellproliferation i myokardiet och differentiering till mogna kardiomyocyter), förhållandet kollagen (medelvärde för godtycklig intensitet, aiu, 100), till fibronektin (40 aiu) till källarmembran (50 aiu) är ganska lik det kritiska värdet som fastställts här. Således kan vår formulering återspegla sena utvecklingsförhållanden förknippade med kardiomyocytdifferentiering och genom att utsätta hjärtprekursorer till denna formulering kan vi tillhandahålla en lämplig trigger för att signalera efterföljande ECM-produktion och ombyggnad som behövs för funktionell mognad 24 .

Det återstår att se om fortsatta förbättringar i kardiomyocytdifferentiering och kanske fungerar in vitro skulle kunna realiseras genom inkludering av mer dunkla ECM-typer av det utvecklande hjärtat 39 . Till exempel är Glypican-3 (Gpc3) en heparinsulfatproteoglykan uttryckt vid utveckling av ryggradsdjur, där Gpc3-bristande möss uppvisar en försenad utveckling av den koronära vaskulära plexus och ett ökat antal koronarartärer relativt antalet vener 40 . Versican är en kondroitinsulfatproteoglykan, vars respektive varianter uttrycks i specifika spatiotemporala mönster under hjärtutveckling 41 . Periostin finns i utvecklingshjärtat och kan interagera med fibronektin, kollagener typ I och V, tenascin-C och sig själv och fungerar som en vidhäftningsmolekyl genom att binda integriner 42 . Slutligen visade man sig att ett nytt protein som heter Abi3bp nyligen spelade en viktig roll i att reglera proliferation och differentiering av hjärtfödselceller via integrinP1 och tillhörande fokalyleringskasasfosforylering 43 . 3D-modellsystemet och motsvarande statistiska tillvägagångssätt som beskrivs här är grundade för att möjliggöra undersökning av rollen för dessa mindre och mindre väl studerade ECM-proteiner i kardiomyogenes.

I denna studie användes analys av Ca 2 + -transienter och kontraktilitet hos cellpopulationer för att bedöma graden av differentiering av kardiomyocyter i den optimala formuleringen jämfört med kontroller. Formen på F / FO-spåren märktes tydligt mellan grupper och ISI var högre för kardiomyocyter som utvecklades i den optimerade formuleringen i förhållande till kontroller (Fig. 5b). I vuxna kardiomyocyter utlöser en relativt liten Ca 2+ -inströmning via spänningsaktiverade L-typ Ca 2+ -kanaler större mängder sarkoplasmatisk retikulum (SR) Ca 2+ frisättning från typ-2 ryanodinreceptorn (RyR2) av Ca 2+ -inducerad Ca 2+ release-mekanism (CICR). Detta leder till en snabb och tillräckligt hög ökning av den intracellulära Ca2 + -koncentrationen för att initiera interaktionen av kontraktila filament och efterföljande sammandragning (dvs. excitation-kontraktionskoppling) 44 . Tidigare arbete visade att EB-härledda kardiomyocyter från pluripotenta celler har heterogena kalciumhanteringsegenskaper 45 och att kardiomyocyter härledda på detta sätt var omogna jämfört med murina ventrikulära kardiomyocyter med avseende på de kontraktila egenskaperna relaterade till SR-funktionen och det inotropa svaret på p -adrenerg stimulering 45 . Observera att utökad elektrofysiologisk undersökning inte var möjlig i denna studie utan att ta bort cellerna från kompositerna, vilket vi visade vara skadligt för cellhälsan. Emellertid möjliggjordes kontraktilitetsstudier via statistisk analys av filmer 30 av sammandragande kardiomyocyter av kompositer i 3D. Ytterligare tillvägagångssätt som liknar dessa måste utvecklas för att bättre bestämma om funktionell mognad av kardiomyocyter förbättras i 3D-odlingsscheman. Ytterligare förfining av denna integrerade plattform kan också inkludera flera tidpunkter och den exakta kontrollen av matrisbundna lösliga faktorer för att bättre uppskatta processen för mognad och punkt för potentiell platå.

Sammanfattningsvis identifierade den integrerade biomaterialplattformen med DoE-metod en optimal ECM-formulering för differentiering av miPSC till kardiomyocyter i frånvaro av stimulering av lösliga faktorer. I framtiden ser vi för oss att denna ECM-formulering, och andra härledda på detta sätt, kommer att användas i samband med löslig faktorstimulering för att förbättra den funktionella kapaciteten hos kardiomyocyter härledda från PSC: er. Potentiella förbättringar kan göras genom att öka mångfalden av ECM-proteiner och matrisbundna faktorer inkluderade i kompositer, bedömning av kinetiken för differentiering i ECM-kompositer och inkludera bättre medel för att bedöma funktionell mognad för härledda kardiomyocyter. Vidare fördelar inkluderar förmågan att tillämpa denna plattform för studien av valfri kardiovaskulär celltyp och tillhörande matris och att använda identifierade formuleringar för basstudier och / eller klinisk vävnadsåtervinning.

metoder

Kultur av murininducerade pluripotenta stamceller (miPSC)

Murininducerade pluripotenta stamceller (miPSC) odlades med användning av tidigare publicerade protokoll 15 . Embryoidkroppar (EB) genererades med användning av hängande droppmetoden endast för Ca 2+ övergående kontroll. I korthet återsuspenderade miPSCs vid 1, 6 x 104 celler / ml i odlingsmedium utan LIF och avsattes i 30 mikroliter droppar på locket på en 100 mm petriskål och suspenderades över 25 ml steril PBS. Hängande droppar pläterades i odlingsmedium utan LIF på gelatinerade plattor under 3 dagar tills Ca 2+ övergående bildbehandling.

Bildande av ECM-kompositer och sammansättning av ECM

Cystein- och tioesterterminerade 4-armade PEG-makromonomerer syntetiserades med användning av tidigare publicerade protokoll och singulariserade 3 x 105 miPSC / komposit inkapslades 15 . Antingen kollagen av råttvans typ I (Col I, katt # 354236, Corning), muslaminin (LN, katt # 354259, Corning) eller humant plasmafibrronektin (FN, katt # 356008, Corning) eller deras blandning specificerad av designen av Experiment (DoE) -metoder neutraliserades vid 37 ° C / 5% CO2. Oavsett formulering hölls styvheten hos kompositer vid 0, 9 kPa (lagringsmodul G ', kompletterande fig S1). Eftersom miPSC: er inkapslades och differentierades, skulle 3D ECM-ställningar vid stelheten av tidig embryonal utveckling 20, 21 vara mer fysiologiskt relevant än myocardium hos vuxna omkring eller över 10 kPa 20 . ECM-kompositer hölls i GMEM-medium vid 37 ° C / 5% CO2 under upp till 21 dagar (mediumändring varje dag).

Extraktion av RNA från ECM-kompositer

Efter 21 dagars odling uppsamlades ECM-kompositer i ett mikrocentrifugrör och lagrades vid -80 ° C med 10 mikroliter Trizol® (katt # 15596-026, Life Technologies) per ECM-komposit. När det töades tillsattes ytterligare 30 mikroliter Trizol® till varje ECM-komposit och separerades mekaniskt med mikropestrar. Efter det att malda ECM-kompositer fick stå under 5 minuter vid rumstemperatur tillsattes 8 ul kloroform och skakades kraftigt av händerna i cirka 15 s. Efter 3 minuter vid rumstemperatur centrifugerades proverna vid 12 000 g under 15 minuter vid 4 ° C, varvid blandningarna separerades i tre faser. Endast en färglös övre vattenfas överfördes till ett nytt mikrocentrifugrör. En lika stor volym av 70% etanol (molekylärbiologisk kvalitet) sattes till varje rör för att göra en blandning av RNA i 35% etanol. Dessa blandningar behandlades i PureLink RNA Mini Kit (katt # 12183-018A, Life Technologies) genom att följa det föreslagna protokollet.

Kvantitativa realtidspolymeraskedjereaktioner (qRT-PCR)

Komplementärt DNA (cDNA) syntetiserades enligt instruktionerna från Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (katt # K1642, Thermo Scientific). Hjärt-troponin T-genprimer (Tnnt2) köptes från Biorad (katt # 10025636). Primereffektivitet extraherades från RealPlex 2- programvaran och verifierades med smältkurvor. Genuttrycksnivån bestämdes som kopiaantalet för Tnnt2 normaliserat till det för Gapdh.

Avbildning av cTnT-, αMHC-, αSA- och Cx43-positiva celler

Efter 21 dagars odling fixerades miPSC i ECM-kompositer med 4% paraformaldehyd under 15 minuter och extraherades med 0, 2% Triton-X 100-lösning under 1 timme vid rumstemperatur. Varje steg utfördes på en vippa, följt av 5 min tvätt med PBS. Efter en 2 timmars inkubation vid rumstemperatur på en vippa med nyberedd blockeringslösning (2, 5 g icke-fett torrmjölk i 50 ml 0, 2% Trion-X 100-lösning), kanin anti-cTnT (katt # MS-295-P0, Thermo Scientific, 1: 200-utspädning i BGST-buffert bestående av 1 g Gly i 88 ml vatten, 10 ml 10 × PBS, 5 g BSA, 2 ml getserum och 100 ul Triton-X 100) antikroppar inkuberades vid 4 ° C över natt, som testades av get-anti-kanin Texas Red (katt # 31500, Pierce, 1: 100-utspädning i BGST) under 90 minuter. ECM-kompositer lagrades i 2, 5% 1, 4-diazabicyklo [2, 2, 2] oktan (katt # D27802, Sigma-Aldrich) i 1: 1 PBS och glycerol med 1 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2- fenylindol (katt # D9542, Sigma-Aldrich) tills avbildning. ECM-kompositer avbildades med ett Olympus IX81ZDC-mikroskop utrustat med 10 × (NA = 0, 25) objektivlins med användning av MetaMorph®-glidavsökningsfunktion för att erhålla 8 med 9 synfält per ECM-komposit (Kompletterande Fig S2). Förhållandet mellan det cTnT-positiva området och DAPI-färgade området mättes med FIJI-programvara. Sarkomeriska proteiner undersöktes av primära antikroppar (alla primära antikroppar utspäddes i 1: 100 i 5% åsnesserum, inkuberades vid 4 ° C över natt) mot Cx43 (katt # sc-9059, Santa Cruz), αMHC (katt # sc-32732, Santa Cruz) och αSA (katt # A-7811, Sigma-Aldrich), som testades av åsnans anti-kanin FITC, katt # 711-545-152, Jackson Immuno Research Lab, 1: 200-utspädning i 5% åsna serum, inkuberat under 1 timme). Efter tvättning med PBS testades F-aktin med TRITC-konjugerat falloidin (katt # FAK100, EMD Millipore, 1: 100-utspädning i 5% åsnesserum, inkuberades under 45 minuter). Cx43-positiva celler visualiserades med en objektivlinsa på 60 x (NA = 1.0) med användning av en modlåst Ti: Sapphire-laser på ett multifoton-laserskanningsmikroskop (MPLSM, Bruker Nano).

Design av experiment (DoE) -metoder och statistiska analyser

Den effektiva undersökningen av det relativa förhållandet mellan flera ECM-proteiner som styr differentieringen av miPSC: er till cTnT-positiva fenotyper underlättades genom den kemoselektiva naturen hos NCL av PEG-hydrogeler. Arbetet fortsatte i två steg: 1) Faktoriella experiment (FE) med flera ECM-proteiner för att bestämma hur signifikant varje ECM-protein påverkade differentieringen av miPSCs till cTnT-positiva fenotyper och huruvida något svar på en viss ECM var beroende på nivån (koncentration) ) av de andra ECM-proteinerna (dvs interaktioner mellan huvudeffekter) och 2) bestämning av ett optimalt relativt förhållande mellan multipel ECM-proteinformulering med användning av svar-ytmetodik (RSM).

I det första steget användes en tvånivå, tre-faktor (2 3 ) design, i vilken varje faktor (Col I, LN och FN) sattes till en hög (0, 83 mg / ml) eller låg nivå ( 0 mg / ml), vilket producerade matrisen för experimentella körningar som visas i tabell 1. Denna konstruktion möjliggjorde identifiering av de mest betydande faktorerna och identifieringen av interaktioner mellan dessa faktorer. JMP-programvara (SAS, North Carolina, USA) användes för att underlätta genereringen av denna experimentella matris, som bestod av åtta (2 3 ) olika formuleringar och en mittpunkt (000) som kan läggas till om faktorerna i designen och svar misstänks ha en kröklig relation. ECM-kompositer framställdes och analyserades i tre exemplar för två olika svar, cTnT-proteinuttryck och Tnnt2-genuttryck, vilket uppgår till 54 totala geler. JMP-programvara användes för att anpassa data, utföra ANOVA för att bestämma betydelse, sortera parameterns uppskattningar och identifiera statistiskt signifikanta faktorer och interaktioner.

I det andra steget användes RSM-experiment för att bestämma en möjlig optimal formulering av flera ECM-proteiner. RSM-experimenten undersökte olika nivåer och intervall av ECM-proteiner i ECM-kompositerna med användning av en central kompositdesign (CCD, tabell 2). Denna design består av 15 olika kombinationer av tre olika faktorer (Col I, LN och FN), i fem olika nivåer. CCD-formuleringarna inkluderade Col I och LN från låg axiell punkt (a, 0 mg / ml) till hög axiell punkt (A, 1, 04 mg / ml) och FN från låg axiell punkt (a, 0 mg / ml) till hög axiell punkt punkt (A, 0, 42 mg / ml). I CCD-formuleringar inkluderades en mittpunkt (000) på grund av RSMs kvadratiska natur. Svaret fixerades på cTnT-uttryck under RSM-experimentella körningar (totalt 45 geler). JMP-mjukvara användes för att anpassa data, utföra ANOVA och brist på anpassningsanalys för att bestämma betydelse och reproducerbarhet, sortera parameteruppskattningar och identifiera de förutsagda lösningarna från svarsytan.

För att bedöma påverkan av matricellulära proteiner på cTnT-uttryckande fenotyper upprepades FE med den liknande metoden som beskrivits ovan med olika formuleringar och nivåer (tabell 3). Nivån (koncentrationen) av trombospondin-1 (TSP1) beräknades utifrån den ytkoncentration som krävdes för beläggningar 46 och transformerades till en volymdensitet för att producera en ECM-komposit.

För alla andra icke-DOE-tillvägagångssätt utfördes envägs ANOVA med Fishers LSD eller Tukeys HSD- post hoc- test för flera jämförelser, där p-värden <0, 05 ansågs vara signifikanta. Åtminstone tre oberoende experiment utfördes.

Hög bildfrekvens DIC och konfokal Ca 2+ transient avbildning

Efter 21 dagars odling utfördes DIC-mikroskopi med hög bildhastighet med ett Nikon TiE Deconvolution-mikroskop utrustat med 10 × (NA = 0, 25) objektiv och Ibidi levande cellmiljökammare minst 150 bilder per sekund (fps) under 30 sekunder. Kontraktil kinetik för differentierade miPSC beräknades med hjälp av baslinjeanpassad likhetsjämförelse (BASiC) kurvmetodik 30 . ECM-kompositer laddades med 5 mikrometer Fluo-4 AM (katt # F14217, Life Technologies) i serumfri GMEM. Efter inkubering vid 37 ° C / 5% CO2 under 30 minuter inkuberades ECM-kompositer under 30 minuter med Tyrodes saltlösning vid 37 ° C / 5% CO2 för att möjliggöra avförestring av intracellulära AM-estrar. Intracellular calcium transients were recorded with a Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal microscope equipped with 20× (NA = 0.5) objective and an environmental chamber (37 °C/5% CO 2 ) at 15–30 fps over 30 to 120 s. Movies were analyzed with FIJI software to acquire fluorescence intensity (F) of 2 to 8 ROIs and 3 to 8 backgrounds (F 0 ) per acquisition. Note, in Supplementary video 3, the lack of calcium transients despite beating. We observed this frequently in the no ECM control (~80% of beating areas lacked evidence of calcium transients).

ytterligare information

How to cite this article : Jung, JP et al. An integrated statistical model for enhanced murine cardiomyocyte differentiation via optimized engagement of 3D extracellular matrices. Sci. Rep. 5, 18705; doi: 10.1038/srep18705 (2015).

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande video S1

  2. 2.

    Kompletterande video S2

  3. 3.

    Kompletterande video S3

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.