En ancca / pro2000-mir-520a-e2f2 regulatorisk slinga som en drivkraft för utveckling av hepatocellulärt karcinom | onkogenes

En ancca / pro2000-mir-520a-e2f2 regulatorisk slinga som en drivkraft för utveckling av hepatocellulärt karcinom | onkogenes

Anonim

ämnen

  • Cell migration
  • onkogener

Abstrakt

Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en av de vanligaste maligniteterna i Asien, särskilt i Kina. Vi identifierade tidigare att ANCCA / PRO2000 som ett viktigt proliferationsassocierat protein förutspådde dålig prognos för patienter med HCC. Emellertid är molekylmekanismerna för ANCCA / PRO2000 som leder till hepatokarcinogenes och progression fortfarande otydliga. I den aktuella studien fann vi att ANCCA / PRO2000-överuttryck i HCC-prover korrelerade med aggressivt tumörbeteende och dålig överlevnad. Vidare utövar ANCCA / PRO2000 stark onkogen funktion i HCC och främjar cellproliferation genom att reglera E2F2-uttryck, en kritisk cellcykelregulator. Noterbart är miR-520a en mellanregulator mellan ANCCA / PRO2000 och E2F2. Mekaniskt samverkar ANCCA / PRO2000 inte bara med E2F2 utan reglerar också negativt miR-520a som hämmar E2F2 att samarbeta främja in vitro och in vivo tillväxt av HCC-celler. Dessutom visade vi att ANCCA / PRO2000 förbättrar migrationskapaciteten för HCC-celler delvis genom att undertrycka ERO1L och G3BP2-uttryck. Ytterligare forskning identifierade att miR-372, som en prognostisk faktor för HCC, direkt kunde rikta in sig på ANCCA / PRO2000. Våra resultat antyder att ANCCA / PRO2000-miR-520a-E2F2-regleringsslingan är en drivkraft för HCC-utveckling och ANCCA / PRO2000 som ett potentiellt terapeutiskt mål för HCC.

Introduktion

Hepatocellulärt karcinom (HCC) är den vanligaste maligniteten i Asien, särskilt i Kina och den femte vanligaste i hela världen och står för en miljon dödsfall årligen. 1, 2 Genetiska förändringar såsom amplifiering, deletion, translokation och omarrangering har visat sig vara de frekventa händelserna och kan ha de viktiga rollerna i patogenesen av HCC. Alla typer av genetiska förändringar kan leda till genavvikande uttryck antingen upp- eller downexpression och därefter leda till onormala biologiska aspekter i cellproliferation, differentiering, rörlighet och överlevnad. Cytogenetiska profileringsstudier har antytt att en delmängd av frekvent förstärkning av kromosomer 1q, 6p, 8q, 17q och 20q, och ofta förlust av kromosomer 1p, 4q, 6q, 8p, 13, 16 och 17p. 3, 4 Förstärkning av kromosomer 1q och 8q har särskilt förknippats med den tidiga utvecklingen av HCC. 4 I regionen av kromosom 8q uppvisades PRO2000 ökat uttryck (4, 7 gånger) i en majoritet av HCC-prover jämförande med motsvarande icke-canceröst prov genom jämförande genomisk mikroarray-analys. Det antydde att PRO2000 kan vara en viktig kandidatgen som är belägen inom en region av kromosom 8q i HCC. 5

PRO2000, även benämnt AAA-kärnkorregulatorcancerassocierat protein (ANCCA) eller AAA-domän som innehåller 2, är en ny medlem i superfamiljen av AAA + (ATPaser associerade med olika cellulära aktiviteter) -proteiner. 6 Den delar det konserverade området av ~ 220 aminosyror som innehåller ett ATP-bindande ställe med de andra medlemmarna i ATPases-familjen. ANCCA / PRO2000-proteinet som kodas av denna gen innehåller två AAA + ATPas-domäner (AAA-D1 och AAA-D2) och en bromodomain. AAA + -familjeproteiner har kritiska roller i olika biologiska processer via deras ATPas-driven ombyggnad av makromolekylära komplex. 7, 8, 9 Flera forskare har identifierat att ANCCA / PRO2000 funktionellt kontrollerar de avgörande reglerna för cellproliferation och överlevnadsvägar inklusive E2F1 / 3, EZH2, B-Myb och MYC vid bröstcancer, prostatacancer, lungadenokarcinom och endometrial cancer. ANCCA / PRO2000 är alltid överuttryckt i cancerceller och korrelerar med dålig överlevnad och återkommande sjukdom. 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 Vi har tidigare identifierat att ANCCA / PRO2000 fungerar som ett viktigt proliferationsassocierat protein och en prediktor för dålig prognos i HCC. 17 Studier från andra avslöjar också att ANCCA / PRO2000 med högt uttryck i HCC kan reglera den proliferativa, invasiva och migrerande kapaciteten hos HCC-celler. 18, 19 Men molekylmekanismen för ANCCA / PRO2000 vid hepatocarcinogenesis och progression är dock oklart ännu.

MicroRNAs (miRNAs) är små icke-kodande RNA: er av ~ 22 nt med en roll i post-transkriptionell reglering av mål messenger RNA (mRNA) -översättning genom att rikta in 3′-otranslaterad region (UTR) av den. Ökande bevis har visat att miRNA har en avgörande roll i flera cellulära processer såsom cellproliferation, differentiering och apoptos. 20, 21 Dessutom har det avvikande uttrycket av miRNA hittats vid tumörgenerering och progression av olika cancerformer, inklusive HCC, som nya klasser av onkogener och tumörsuppressorer genom att direkt rikta in sig på många kritiska proteinkodande gener. 22, 23, 24 Exempelvis främjar miR-423 celltillväxt och reglerar G1 / S-övergången genom att rikta in sig på p21Cip1 / Wafl. 25 MiR-124 hämmar den invasiva och metastatiska potentialen av HCC genom dess mål på ROCK2 och EZH2 gener. 26 Tidigare studier visade att miR-520a var associerad med spridning och progression av esophageal skivepitelcancer och icke-småcellig lungcancer, 27, 28 men dess funktion i HCC är fortfarande okänd. Som viktiga modifierare efter transkription har rapporterats att fler och fler miRNA: s orkestrerar regleringen av cellulära signaleringsnätverk genom att fungera som kritiska mellanliggande regulatorer för en rad viktiga reglerande slingor. 29, 30 Karakterisering av dessa miRNA-medierade reglerande slingor kan vara av stor betydelse för att förstå de molekylära mekanismerna som bidrar till utvecklingen av HCC.

I denna studie undersökte vi först den biologiska funktionen av ANCCA / PRO2000-uttryck i HCC, som en kritisk onkogen faktor. 31 Därefter tillhandahöll vi in vitro- och in vivo- bevis som antydde att ANCCA / PRO2000 inte bara kunde interagera med E2F2 utan också negativt reglera miR-520a som hämmar E2F2 för att samarbeta främja cellproliferation och tumörxenografttillväxt av HCC. Dessutom visade vi att ANCCA / PRO2000 förbättrar migrationsförmågan hos HCC-celler delvis genom att undertrycka endoplasmatisk retikulumoxidoreduktin 1 (ERO1L) och Ras-GTPas-aktiverande protein-SH3-domänbindande protein 2 (G3BP2) -uttryck. Ytterligare forskning identifierade att miR-372, som en prognostisk faktor för HCC, direkt kunde rikta in sig på ANCCA / PRO2000.

Resultat

Uttryck av ANCCA / PRO2000 och dess korrelation med klinikopatologiska egenskaper och prognos i HCC

För att förstå den klinikopatologiska betydelsen av ANCCA / PRO2000 i HCC-vävnad analyserades totalt 221 HCC-patienter som hade genomgått tumörresektion genom immunohistokemi-färgning. ANCCA / PRO2000-uttryck lokaliserades i cancercellerna, medan få spridda positiva celler detekterades i intilliggande icke-tumörvävnader (figur la). Intensiteten för ANCCA / PRO2000-färgning i cancerceller var mycket starkare än i celler som inte var cancer (figur 1b). Tabell 1 sammanfattade sambandet mellan ANCCA / PRO2000-uttryck och klinikopatologiska egenskaper hos HCC-patienter. Genom Pearson χ 2- test indikerade resultaten att ANCCA / PRO2000-uttryck signifikant förknippades med tumörstorleken, tumörantalet, tumördifferentiering, cirrhos, tumormodmetastassteg (TNM) stadier, venös metastas, mikrosatellittumörer och återfallet, medan signifikanta skillnader observerades med avseende på kön, ålder, serum HBsAg och serum alfa-fetalt protein (AFP) (tabell 1). Kaplan – Meier överlevnadskurvor och univariat analys avslöjade att högnivåuttryck av ANCCA / PRO2000 var korrelerade med kort total överlevnad för HCC-patienterna ( P <0, 001; figur 1c, tabell 2). Ytterligare multivariat analys visade att ANCCA / PRO2000 var oberoende prognostisk faktor för HCC-patienter (tabell 2).

Image

Avvikande uttryck av ANCCA / PRO2000 i HCC korrelerades med dålig patientöverlevnad. ( a ) Representativ immunohistokemi färgning av ANCCA / PRO2000 i HCC (T) och intilliggande icke-tumörvävnader (N). Vyn för nedre förstoring visades till vänster och vyer med högre förstoring till höger. ( b ) ANCCA / PRO2000 uttrycksbedömning som integrerade poäng för optisk densitet. ** P <0, 01. P- värden bestämdes med användning av oberoende T- test. ( c ) Kaplan – Meier-analys av total överlevnad hos 221 patienter med HCC baserat på ANCCA / PRO2000-uttryck. - negativt; +, måttligt positivt; ++, stark positiv. Skalstänger, 100 μm ( a, vänster); 20 μm ( a, höger).

Bild i full storlek

Full storlek bord

Full storlek bord

ANCCA kan främja tillväxt och invasion av HCC-celler in vitro

Det betydande förhöjda uttrycket av ANCCA / PRO2000 i HCC-vävnader fick oss att undersöka dess effekt på proliferation av HCC-celler. Western blotting avslöjade att HCC-cellinjer uppvisade signifikant förhöjda nivåer av ANCCA / PRO2000 jämfört med normal levercellinje L02. Dessutom verkade HepG2- och Huh7-celler uttrycka högre nivåer av ANCCA / PRO2000 än Hep3B- och Hep40-celler (figur 2a). Följaktligen valdes L02-, HepG2- och Huh7-cellinjerna för att studeras vidare i följande forskning.

Image

Uttryck av ANCCA / PRO2000 i levercellinjer. ( a ) Western blottinganalys av ANCCA / PRO2000-proteinuttryck i levercellinjer L02, HepG2, Hep3B, Huh7 och Hep40. ( b ) qRT – PCR och western blotting-analyser bekräftade att nedreglering av ANCCA / PRO2000 i HepG2 och Huh7 via siANCCA (100 pmol) och uppreglering i L02-celler av pcDNA3.1-ANCCA (2 μg). ( c ) qRT – PCR och western blotting-analyser av ANCCA / PRO2000-uttryck i HepG2- och Huh7-celler infekterade med lentivirala partiklar av shANCCA. Felfält indikerar medelvärde ± sd från tre oberoende experiment. * P <0, 05; ** P <0, 01. P- värden bestämdes med användning av oberoende T- test.

Bild i full storlek

Därefter användes små störande RNA: er (siRNA) som är inriktade på ANCCA / PRO2000 (siANCCA-1, siANCCA-2 och siANCCA-3) eller korta hårnål-RNA som är inriktade på ANCCA / PRO2000 (shNCCA-1, shANCCA-2 och shANCCA-3) för att undertrycka ANCCA / PRO2000-uttryck i HepG2- och Huh7-celler. ANCCA / PRO2000-överuttrycksplasmid (pcDNA3.1-ANCCA) transfekterades in i L02-celler för att uppreglera ANCCA / PRO2000-uttryck. Kvantitativ omvänd transkription PCR (qRT – PCR) och western blotting-analyser bekräftade effekten av siANCCA, shANCCA och pcDNA3.1-ANCCA (figurerna 2b och c).

Sedan utfördes CCK-8- och kolonibildningsanalyser för att mäta cellproliferation och tillväxt. Såsom visas i figur 3a minskade livskraften hos HepG2- och Huh7-celler transfekterade med siANCCA signifikant jämfört med den hos kontroll-siRNA (siCtrl) -behandlade celler, medan uppreglering av ANCCA / PRO2000 i L02-celler markant främjade celltillväxt. Vidare observerades en statistiskt signifikant minskning av kolonibildningen mellan siANCCA-behandlade celler och kontrollerna, och antalet kolonier ökade i ANCCA / PRO2000-överuttryck L02-celler (figur 3b). Flödescytometri-analys fann att både HepG2- och Huh7-celler visade ökade procenttal i G0 – G1-fasen efter ANCCA / PRO2000-nedreglering, vilket parallellt med minskade procenttal i S-fasen. Konsekvent förhindrade överuttryck av ANCCA / PRO2000 cellcykelstopp i L02-celler med en högre procentsats i S-fas och en lägre procentandel i G0 – G1-fas (figur 3c). Dessa data antydde att ANCCA / PRO2000 påverkade cellernas proliferation av levercancer genom att störa cellcykelprogressionen.

Image

ANCCA / PRO2000 påverkade cellproliferation in vitro genom att störa cellcykelprogressionen. ( a ) Proliferationsanalyser av HepG2-, Huh7- och L02-celler med förändrat ANCCA / PRO2000-uttryck. Varje prov analyserades i triplikat under 6 på varandra följande dagar. ( b ) Analyser av klonbildande (övre) och mjuk-agar koloni (nedre) analyser av HepG2-, Huh7- och L02-celler. Representativa fotografier visas och antalet kolonier räknades. Skala, 100 μm. ( c ) FACS-analys av fördelningen av celler i varje cellcykelfas. Representativa FACS-profiler visades, på vilka siffror indikerar procenttal celler i G0 / G1, S eller G2 / M-fasen. Felfält indikerar medelvärde ± sd från tre oberoende experiment. * P <0, 05; ** P <0, 01. P- värden bestämdes med användning av oberoende T- test.

Bild i full storlek

Vi undersökte vidare om ANCCA / PRO2000 krävdes för migrations- och invasivfunktioner. Analysen med sårläkning och transwellmigration visade att ANCCA / PRO2000 knockdown dämpade cellrörlighet i HepG2- och Huh7-celler jämfört med den i siCtrl-behandlade celler (figur 4a och b). På liknande sätt visade matrigelinvasionanalysen att invasiviteten hos ShANCCA-behandlade HepG2- och Huh7-celler var signifikant lägre (figur 4c). Samtidigt observerades motsatta resultat också i ANCCA / PRO2000 överuttryckande L02-celler (figur 4). Sammantaget visade både förlust- och vinst-av-funktionsexperiment att ANCCA / PRO2000 främjade cellmigrationen och invasiviteten för HCC-celler in vitro .

Image

ANCCA / PRO2000 främjade cellmigrationen och invasiviteten för HCC-celler in vitro . ( a ) Cellmigrering kvantifierades genom sårläkande analys. Celler avbildades omedelbart (0 timmar) och 48 timmar efter repor skapades för att mäta procentandelen sårläkt område. Representativa bilder vid olika tidpunkter visas. Skala, 150 μm. ( b, c ) Transwellcellmigrationsanalys ( b ) och Matrigel invasionanalys ( c ). Representativa fotografier visas i de övre panelerna. Kvantitativa mätningar visas i de nedre panelerna. Data representerar medelvärde ± sd för tre oberoende experiment. Skalstänger, 100 μm. * P <0, 05; ** P <0, 01.

Bild i full storlek

ANCCA / PRO2000 förbättrar tumörgeniciteten hos HCC-celler in vivo

De tumörgena egenskaperna hos ANCCA / PRO2000 in vivo genomfördes i naken mus xenograft. Figurerna 5a och b visade den subkutana tumörtillväxten av HepG2 och Huh7 infekterad med shANCCA eller kontroll-kort hårnål RNA (shCtrl). Tumörtillväxten var signifikant långsammare hos nakna möss ympade med shANCCA-infekterade HepG2- och Huh7-celler jämfört med vektorkontrollmössen. I överensstämmelse med tumörtillväxtkurvan var de genomsnittliga tumörvolymerna för shANCCA-infekterade HepG2- och Huh7-celler betydligt mindre än kontrollcellerna. Vidare uppvisade ANCCA / PRO2000 överuttryck L02-celler accelererad tumörbildning och signifikant större tumörstorlek jämfört med kontrollcellerna. Därför drog vi slutsatsen att ANCCA / PRO2000 fungerade som en potentiell onkogen av HCC både in vitro och in vivo.

Image

ANCCA / PRO2000 förbättrade tumorigeniciteten hos HCC-celler i nakna möss. ( a ) Tumörbildning av celler stabilt med antingen hög eller låg ANCCA / PRO2000-uttryck ( N = 3 eller 4 möss för varje grupp). ( b ) Tillväxtkurva för tumörvolymer. ( c ) Western blottinganalys av ANCCA / PRO2000 och E2F2-proteinuttryck i tumörxenografts. Felstegen representerar medelvärde ± sd * P <0, 05; ** P <0.01, kontra shCtrl eller pcDNA3.1.

Bild i full storlek

Identifiering av ANCCA / PRO2000-associerade gener för att kontrollera celltillväxt av levercancerceller

För att identifiera molekylära mål associerade med ANCCA / PRO2000 applicerades en cDNA-mikroarrayanalys på HepG2-celler transekterade med siANCCA. Tolv gener nedreglerades och 25 gener uppreglerades i mer än tvåfaldigt i siANCCA-behandlade celler (figur 6a). Bland dessa gener var E2F2 som nedreglerades för 2, 58 gånger den enda cellcykelrelaterade genen med ANCCA / PRO2000-utarmning. På basis av mikroarray-data utfördes qRT – PCR och western blotting-analys för att bekräfta om E2F2 var ANCCA / PRO2000-associerad gen i levercancerceller. Jämfört med siCtrl-behandlade celler visade siANCCA-behandlade celler en blygsam minskning av E2F2 vid både mRNA- och proteinnivåer i HepG2- och Huh7-celler (figur 6b).

Image

Identifiering av ANCCA / PRO2000-associerade gener för att kontrollera celltillväxt av levercancerceller. ( a ) Oövervakad hierarkisk klusteranalys av differentiellt uttryckta gener screenade med cDNA-mikroarray. Rader, biologiska prover; kolumner, mRNA; rött, uttrycksvärde högre än genomsnittligt uttryck i alla sampel blå, uttrycksvärde lägre än genomsnittet. E2F2 indikeras med röd ruta, och ERO1L och G3BP2 indikeras med blå ruta. ( b ) qRT – PCR och western blotting validerade signifikant hämning av E2F2-uttryck i siANCCA-behandlade celler. Data representerar medelvärde ± sd för tre oberoende experiment. ( c, d ) Representativ immunohistokemi färgning och intensitet av ANCCA / PRO2000 och E2F2 i HCC vävnader. Skalstänger, 200 μm. ( e ) Föreningen mellan ANCCA och E2F2 analyserades genom samimmunutfällning i HepG2- och Huh7-celler behandlade med siANCCA eller siCtrl. * P <0, 05; ** P <0, 01 mot siCtrl.

Bild i full storlek

I överensstämmelse med de resultat som observerades vid knockdown av ANCCA / PRO2000 in vitro , avslöjade western blotting en markant minskning av E2F2 i shANCCA-behandlade celler jämfört med shCtrl-behandlade celler i musxenografttumörer (figur 5c). Dessutom analyserade vi ANCCA / PRO2000 och E2F2 proteinuttryck i HCC-vävnad med användning av immunohistokemi. E2F2-uttryck är positivt korrelerat med ANCCA / PRO2000 i cancerceller (figur 6c och d).

Ovanstående data visade bevis på att ANCCA / PRO2000 kan vara nära förknippade med E2F2. Ytterligare samimmunutfällning (co-IP) visade att ANCCA / PRO2000 kunde interagera E2F2 genom protein-proteinbindning. (Figur 6e). Dessutom åtföljdes E2F2 med en kraftig minskning av ANCCA / PRO2000 i siANCCA-behandlade HepG2- och Huh7-celler. Ovanstående resultat indikerade att ANCCA / PRO2000 reglerar E2F2-expression vid både mRNA- och proteinnivåer.

miR-520a är en mellanregulator mellan ANCCA / PRO2000 och E2F2

En tidigare litteratur antydde att miR-520a knappt uttrycktes och kunde undertrycka celltillväxt i HCC. 32 Sedan testade vi vidare huruvida ANCCA / PRO2000 kunde modulera miR-520a genom att mäta uttrycket miR-520a efter tystnad av ANCCA / PRO2000 i HCC-celler. Resultaten visade att uttrycket miR-520a var märkbart förhöjd när ANCCA tystades med siRNA (figur 7a). I överensstämmelse med upptäckten in vitro visade qRT – PCR-analys en markant ökning av uttrycket miR-520a i shANCCA-behandlade celler jämfört med det i shCtrl-behandlade celler i xenograft-tumörer (figur 7b).

Image

miR-520a är en mellanregulator mellan ANCCA / PRO2000 och E2F2. ( a ) ANCCA / PRO2000 reglerar omvänt miR-520a-uttryck i HepG2- och Huh7-celler. ( b ) qRT – PCR-analys av miR-520a-uttryck i tumörxenografts. ( c ) Förutspådda bindningsställen för miR-520a i E2F2 3′-UTR. ( d ) E2F2-uttryck analyserades genom western blotting i HepG2- och Huh7-celler efter transfektion med miR-520a-efterlikningar ensam, kombinationen av miR-520a-efterlikningar och pcDNA3.1-E2F2 eller motsvarande kontroller. ( e ) Celltillväxtkurvor för HepG2- och Huh7-celler. ( f ) Plåtklonbildande analys av HepG2- och Huh7-celler. Representativa fotografier visas och antalet kolonier räknades. ( g ) FACS-analys av fördelningen av celler i varje cellcykelfas. Data visas som medelvärde ± sd härrörande från tre oberoende experiment. * P <0, 05; ** P <0, 01, mot siCtrl, efterliknar kontroll eller miR-520a efterliknar + pcDNA3.1.

Bild i full storlek

Eftersom miRNA kan reglera sitt målgenuttryck, genomfördes en bioinformatisk sökning efter förmodade genR-mål gen-par. Intressant nog förutspådde båda två oberoende förutsägelsesprogram (TarScan och miRanda) E2F2 som ett förmodat mål för miR-520a eftersom det finns en exakt matchning mellan E2F2 3′-UTR och miR-520a (figur 7c). För att avgöra om miR-520a kan modulera E2F2-uttryck transfekterade vi HepG2- och Huh7-celler med miR-520a-mimics eller mimics-kontroll. Resultaten visade att E2F2-uttryck reducerades signifikant vid både mRNA- och proteinnivåer efter behandling med miR-520a-efterlikningar (figur 7d), vilket antyder att miR-520a kunde hämma E2F2-expression.

Därefter utförde vi CCK-8 och platt-klonbildande analyser för att bekräfta om miR-520a förtryckte celltillväxt i HCC som tidigare rapporterats. Såsom visas i figurerna 7e och f försämrades livskraften hos HepG2- och Huh7-celler transfekterade med miR-520a-mimik signifikant jämfört med den för efterliknade kontrollbehandlade celler, och antalet kolonier minskade också efter införandet av miR-520a-efterlikningar. Vidare användes flödescytometri för att analysera cellcykelfördelningen. Procentsatserna av HepG2- och Huh7-celler exponerade för miR-520a-efterlikningar i G0 – G1-fasen ökade jämfört med den hos efterliknade kontrollbehandlade celler, vilket åtföljdes av en minskning av den i S- eller G2-fasen (figur 7g). Dessa data indikerade att miR-520a undertryckte celltillväxt i HCC genom att störa cellcykelprogressionen.

För att ytterligare undersöka om miR-520a påverkar celltillväxt på ett E2F2-beroende sätt transfekterade vi E2F2-överuttrycksplasmid (pcDNA3.1-E2F2) eller kontrollplasmid (pcDNA3.1) till miR-520a efterliknade behandlade HCC-celler. qRT – PCR och western blotting-analyser visade att E2F2-uttryck var märkbart förhöjda i HCC-celler samtransfekterade miR-520a-efterlikningar och pcDNA3.1-E2F2 (figur 7d). Dessutom, såsom framgår av resultaten i figurerna 7e – g, kunde E2F2-överuttryck upphäva effekten av miR-520a-efterlikningar på celltillväxt genom att främja cellcykelprogression. Sammantaget antyder dessa resultat att ANCCA / PRO2000-miR-520a-E2F2 reglerande slinga har en kritisk funktion för att främja celltillväxt i HCC.

ERO1L och G3BP2 kan vara målgener för ANCCA / PRO2000

Bland 25 uppreglerade gener i cDNA-mikroarrayanalysen var ERO1L och G3BP2 överuttryckta för 2, 4 respektive 3, 2 gånger. qRT – PCR och western blotting utfördes för att bekräfta om ERO1L och G3BP2 var ANCCA / PRO2000-riktade gener i HCC-celler. Jämfört med proteinnivåer i HepG2- och Huh7-celler transfekterade med ANCCA-siRNA (figur 8a).

Image

ERO1L och G3BP2 kan vara målgener för ANCCA / PRO2000. ( a ) qRT – PCR och western blotting validerade signifikant uppreglering av ERO1L- och G3BP2-uttryck i siANCCA-behandlade celler. Data representerar medelvärde ± sd för tre oberoende experiment. ( b ) Föreningen mellan ANCCA och ERO1L eller mellan ANCCA och G3BP2 analyserades genom samimmunutfällning i HepG2-cell. * P <0, 05; ** P <0, 01, mot siCtrl.

Bild i full storlek

För att undersöka om ERO1L och G3BP2 interagerar med ANCCA / PRO2000 i HCC-celler, genomförde vi sedan co-IP-analys. Såsom visas i figur 8b, visade ERO1L och G3BP2 co-immunutfällning med ANCCA / PRO2000 anti-antikropp en kraftig ökning av siANCCA-behandlade HepG2-celler. Dessa resultat visar tydligt att ANCCA / PRO2000 negativt reglerar ERO1L och G3BP2 genom respektive interaktion med dem.

ERO1L och G3BP2 hämmar migrering av HCC-celler in vitro

Det omvända förhållandet mellan ERO1L / G3BP2 och ANCCA / PRO2000 fick oss att undersöka deras effekter ytterligare i HCC-celler. ERO1L / G3BP2-knockdown med RNA-interferens (siERO1L och siG3BP2) och uppreglering med höguttrycksplasmid (pcDNA3.1-ERO1L och pcDNA3.1-G3BP2) försöktes i HepG2, Huh7 och L02-celler (figur 9a). Resultaten av sårläkningsanalysen visade att ERO1L / G3BP2-knockdown genom siRNA ökade cellrörlighet i HepG2- och Huh7-celler och ERO1l / G3BP2-överuttryck av höguttrycksplasmid minskade cellrörlighet i L02-celler jämfört med den i kontrollceller (figur 9b). Liknande resultat observerades i transwellmigrationsanalyser (figur 9c). Sammantaget indikerade dessa observationer att ERO1L / G3BP2 hämmar HCC-cellmigration.

Image

ERO1L / G3BP2 inhiberade migrationen av HCC-celler in vitro . ( a ) qRT – PCR och western blotting-analyser bekräftade att nedreglering av ERO1L / G3BP2 i HepG2- och Huh7-celler via siRNA och uppreglering i L02-celler av pcDNA3.1-ERO1L / G3BP2. ( b ) Sårläkningsanalys av HepG2-, Huh7- och L02-celler. Celler avbildades 0 och 48 timmar efter att repor skapades för att mäta procentandelen sårläkt område. Representativa bilder vid olika tidpunkter visas. Skala, 500 μm. ( c ) Transwellcellmigrationsanalys av HepG2-, Huh7- och L02-celler. Representativa fotografier visas i de övre panelerna. Skala bar, 100 um. * P <0, 05; ** P <0, 01, mot siCtrl.

Bild i full storlek

ANCCA / PRO2000 är ett direkt mål för miR-372

Det accepteras vanligtvis att genuttryck regleras av miRNA. Genom bioinformatikanalys förutsågs miR-372 / miR-373 / miR-106b / miR-93 att ha en potentiell interaktionsplats vid 3′-UTR för ANCCA / PRO2000 mRNA (kompletterande figur S1a). För att verifiera om ANCCA / PRO2000-uttrycket regleras av dessa fyra kandidat-miRNA: er transfekterade vi HepG2- och Huh7-cellerna med de fyra miRNA: er som härmar och hämmare och mätte sedan nivån av ANCCA / PRO2000 med qRT – PCR och western blotting. Expression av ANCCA / PRO2000 minskade efter transfektion av mim-mi2-372, medan miR-372-hämmare inte uppreglerade uttrycket av ANCCA / PRO2000 som förväntat (kompletterande figurer S1c och d). Denna konflikt berodde på misslyckandet av miR-372-hämmare att minska nivån av miR-372, vilket kan förklaras av instabiliteten hos miRNA-hämmare efter transfektering i celler (kompletterande figurer S2a och b). Dessutom minskade livskraften hos HepG2- och Huh7-celler transekterade med miR-372-mimik signifikant jämfört med den för efterliknade kontrollbehandlade celler (kompletterande figur S1e). Resultaten av luciferasrapporten indikerade att miR-372 direkt riktade sig mot 3′-UTR för ANCCA / PRO2000 i HCC-celler (kompletterande figur Sb). Ingen signifikant skillnad i uttrycket ANCCA / PRO2000 observerades i celler behandlade med andra tre miRNA: er som härmar och hämmare jämfört med kontrollerna (kompletterande figurer S2c, b och e).

För att ytterligare utvärdera klinisk betydelse av miR-372 i HCC-vävnader, undersökte vi miR-372-uttryck i 46 HCC-prover. Enligt medianvärdet för expression av miR-372, delades 46 fall av HCC upp i gruppen höghalt i miR-372 ( n = 23) och gruppen låg nivå av miR-372 ( n = 23). Nivån för expression av miR-372 nedreglerades signifikant i HCC-vävnader än den i normala levervävnader (kompletterande figur S1f). χ 2- test visade att ANCCA / PRO2000-protein var negativt korrelerat med expressionsnivån på miRNA-372 (kompletterande tabell S3). Dessutom korrelerades miR-372-nivån negativt med tumörantal, tumördifferentiering, cirros, venös metastas, TNM-steg och återfall (kompletterande tabell S4). Kaplan – Meier-analys visade att HCC-patienter med hög miR-372-nivå tenderade att ha en mer gynnsam prognos jämfört med den låga miR-372-nivån (kompletterande figur S1g).

Diskussion

I det nuvarande arbetet avslöjade vi en ny ANCCA / PRO2000-miR-520a-E2F2-regleringsslinga som utövar en avgörande roll för att reglera cellproliferation i HCC (figur 10). Mer specifikt fann vi att ANCCA / PRO2000 positivt modulerar E2F2-expression vid både mRNA- och proteinnivåer. Vidare undertrycker ANCCA / PRO2000 samtidigt uttrycket av miR-520a som kan inriktas på E2F2, för att förbättra cellproliferation genom att främja cellcykelprogression i HCC. Denna reglerande slinga visar en samordnad och samordnad mekanism för ANCCA / PRO2000 för att reglera cellproliferation i samband med HCC. Förutom cellproliferation presenterade vi också bevis som tyder på att ANCCA / PRO2000 är delaktigt i cellmigrering delvis genom att negativt reglera ERO1L- och G3BP2-uttryck. Våra resultat klargjorde de biologiska rollerna och den underliggande molekylära mekanismen för ANCCA / PRO2000 och föreslog en väsentlig funktion av ANCCA / PRO2000-miR-520a-E2F2 reglerande slinga i utvecklingen av HCC.

Image

Schematiskt diagram över ANCCA / PRO2000-miR-520a-E2F2 reglerande slinga i HCC.

Bild i full storlek

Tidigare arbete från vårt laboratorium identifierade att ANCCA / PRO2000 som ett proliferationsassocierat protein förutsäger dålig prognos hos patienter med HCC. 17 Nya studier antydde också att ANCCA / PRO2000 utövar stark onkogen funktion baserat på undersökningarna av cellproliferation, migration och invasion i HCC. 18, 19 Men hittills har nedströmsmål och molekylära mekanismer relaterade till dess onkogena aktivitet inte undersökts korrekt. Vi visar här att ANCCA / PRO2000 kan främja cellförökning genom att påskynda cellcykelprogression. In vivo- bevis visade också att ANCCA / PRO2000-hämning försenar tillväxten av xenotransplantat av tumörer, men vi har inte undersökt dess effekt på musens överlevnadstid. Vidare identifierades genom bioinformatik och integrativa analytiska tillvägagångssätt ANCCA / PRO2000-associerade gener och E2F2 bland dem var den enda genen som är inblandad i cellcykelreglering. E2F2, som medlem av E2F-familjen av transkriptionsfaktorer, har en avgörande roll i kontrollen av G1 / S-övergången och DNA-replikering i däggdjursceller. 33 Överuttryck av E2F2 detekterades under c-myc och c-myc / TGFa-inducerad hepatokarcinogenes i transgenetiska möss. 34 I den aktuella studien inhiberade borttagningen av ANCCA / PRO2000 HCC-celltillväxt och cellcykelprogression tillsammans med nedregleringen av E2F2-uttryck. För att ytterligare undersöka den potentiella mekanismen hur ANCCA / PRO2000 reglerar E2F2, fann vi att ANCCA / PRO2000 interagerar med E2F2 genom co-IP-analys.

Spännande, våra resultat avslöjade också att miR-520a, knappt studerad i HCC, är en avgörande medlare mellan ANCCA / PRO2000 och E2F2. ANCCA / PRO2000 undertryckte starkt miR-520a-uttryck, vilket framgår av en signifikant ökning av de intracellulära nivåerna av miR-520a vid ANCCA / PRO2000-tystnad in vivo och in vitro . Med tanke på att omfattande bevis avslöjade att miRNA har viktiga roller i HCC-progression genom basparring med 3′-UTR för mål-mRNA, 25, 26 upptäckte vi att E2F2-mRNA kan vara ett mål för miR-520a med prediktionsanalys baserat på sekvensen . Ytterligare studier bekräftade att miR-520a negativt modulerar E2F2-uttryck och förtryckte cellproliferation på ett E2F2-beroende sätt. E2F: s roll i matsmältningssjukdomar dikteras ofta av statusen för vitala cellcykelregulatorer, såsom pRb, p16 INK4A, med många E2F-involverade intrikata slingor. 35, 36 Således avslöjade ovanstående resultat att ANCCA / PRO2000-miR-520a-E2F2-regulatorisk slinga samarbete främjade cellproliferation i HCC-celler.

Bland ANCCA / PRO2000-associerade gener var ERO1L- och G3BP2- uttryck negativt korrelerade med ANCCA / PRO2000. ERO1L, som ett hypoxiainducerbart endoplasmatisk retikulum-bosatt oxidas, har rapporterats katalysera bildningen av disulfidbindning som är kritisk för proteinvikning. 37, 38 Prickfelfoldning är alltid involverad i cancer, vilket antyder att ERO1L-uttryck kan ha en roll i cancer. När det gäller G3BP2, kopplas det direkt till SH3-domänen av GTPas-aktiverande protein som fungerar som en hämmare av RAS och är nära besläktad med P53. 39, 40 Men för närvarande är rollerna för ERO1L och G3BP2 i HCC begränsade. Här visade vi att ANCCA / PRO2000 negativt kunde modulera uttrycket för både ERO1L och G3BP2 genom interaktion med dem. Dessutom inhiberade ERO1L och G3BP2 signifikant HCC-cellmigration, vilket antydde att ANCCA / PRO2000 kunde förbättra cellmigrationsförmågan åtminstone delvis genom att negativt reglera ERO1L- och G3BP2-uttryck.

I en tidigare studie rapporterades att ANCCA / PRO2000 var målet för miR-372. 18 I denna studie bekräftade vi den tidigare upptäckten och fann vidare att överuttryck av miR-372 ledde till en signifikant minskning av ANCCA / PRO2000-uttrycket och en uppenbar hämning av cellproliferation. Dessutom visades det lägre uttrycket miR-372 i vävnader i HCC väsentligt korrelera med mer aggressivt tumörbeteende och indikerade dålig prognos för HCC-patienter.

Sammanfattningsvis klargör vår studie den biologiska funktionen av ANCCA / PRO2000 i HCC som är i god överensstämmelse med tidigare resultat, och vi ger en ny inblick i nya mekanismer för ANCCA / PRO2000 som reglerar cellproliferation och migration. Så vitt vi vet är detta det första beviset på ANCCA / PRO2000-miR-520a-E2F2 regulatorisk slinga som en drivkraft för HCC-utveckling, och förändrade komponenter i denna reglerande slinga kan representera attraktiva terapeutiska mål. Visst måste effekterna av denna slingmålriktning fortfarande utvärderas i normala hepatocyter för att definiera dess potentiella terapeutiska värde mer exakt. Dessutom gav den aktuella studien viktiga ledtrådar för att undersöka nyckelrollerna för det icke-kodande RNA-medierade regleringsnätverket i HCC-progression.

Material och metoder

Etik uttalande

Alla procedurer utfördes enligt riktlinjerna från Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. Denna studie godkändes av Etikkommittén vid Central South University och alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och antalet använda djur. Alla vävnaderna var resten av proverna i patologiavdelningen och denna studie godkändes av etikkommittén vid Zhujiang-sjukhuset anslutet till Southern Medical University (2013-ZLZX-004). Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter för att publicera denna rapport.

Vävnadsprover

Parafin-inbäddade primära HCC-prover från arkiv erhölls från 221 patienter genom kirurgisk resektion på vår avdelning mellan januari 2008 och juni 2012. Åtta normala mänskliga levervävnader erhölls från den distala vävnaden i leverhemangiom. HCC-patienterna, 190 män (85, 97%) och 31 kvinnor (14, 03%), varierade i ålder från 25 till 79 år (medelvärde 50). Klinikopatologiska egenskaper hos studiepopulationen presenterades i tabell 1. Alla prover granskades oberoende av två patologer. Fallen av HCC klassificerades enligt kriterierna beskrivna av Edmondso-Steiner 28 och grupperades som väl differentierade (grad I – II; n = 173) eller dåligt differentierade (grad III – IV; n = 48). Alla 221 prover innehöll perikarcinomatösa vävnader, i vilka inkluderade 120 fall med cirros. Alla vävnader fixerades i 10% formalin och inbäddades i paraffinvax och sedan skars 4 mikrosekvenssnitt. Alla vävnader fixerades i 10% formalin (pH 7, 0) under 12–24 timmar och inbäddades i paraffinvax och sedan skars 4 mikrosekvenssnitt och monterades på poly-lysinbelagda objektglas.

Cellinjer, reagenser, antibiotika och antikroppar

Huh7-, Hep3B-, Hep40- och L02-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM; Gibco, Grand lsland, NY, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Gibco). HepG2-celler odlades i Eagles minimalt viktiga medium (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Gibco). Cellerna hölls vid 37 ° C i en fuktig atmosfär av 5% CO2. HepG2- och Huh7-celler som stabilt downexpressing ANCCA / PRO2000 genererades genom lentivirala partiklar av kort hårnål RNA som var inriktade på ANCCA / PRO2000 mRNA (shANCCA-1, shANCCA-2 och shANCCA-3) -infektion och puromycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). HepG2- och Huh7-celler stabilt överuttryckande E2F2 genererades genom transfektion med pcDNA3.1-E2F2 och G418 (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA) val. CL48-celler stabilt med ANCCA / PRO2000-överuttryck genererades genom transfektion med pcDNA3.1-ANCCA / PRO2000 och G418-selektion. ANCCA / PRO2000 antiserum genererades av Covance genom att immunisera kaniner med rekombinant ANCCA / PRO2000 N-terminusprotein (aminosyror 1–264) uttryckt och renat från Escherichia coli . Antikroppar specifika mot E2F2 (sc-633) och p-aktin var från Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA, USA). Antikroppar specifika för ERO1L (ab81959) och G3BP2 (ab86135) var från Abcam Inc (Cambridge, Storbritannien).

Plasmider, oligonukleotider och transfektioner

De lentivirala partiklarna av shANCCA (shANCCA-1, shANCCA-2 och shANCCA-3) och shCtrl köptes från GenePharma Inc (Shanghai, Kina; kompletterande tabell S1). ANCCA / PRO2000-uttrycksplasmiden var en gåva från HW Chen (UC Davis, Cancer Center, USA). E2F2-, ERO1L-, G3BP2-överuttrycksplasmiderna (pcDNA3.1-E2F2, pcDNA3.1-ERO1L, pcDNA3.1-G3BP2) köptes från GeneChem Inc. (siG3BP2), siCtrl, miR-372 / miR-373 / miR-106b / miR-93 / miR-520a efterlikningar, hämmare och negativ kontroll var från GenePharma Inc (kompletterande tabell S1). Celler ympades med en densitet av 2-3 x 105 celler per brunn i sex-brunnars plattor med DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum under 24 timmar. Celler i den exponentiella tillväxtfasen transfekterades sedan med plasmiderna (2 ug) eller oligonukleotider (100 pmol) med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) efter tillverkarens protokoll.

Analyser av cellproliferation och kolonibildning

Cellproliferation mättes med hjälp av CCK-8-analyspaketet (Dojindo Corporation, Kumamoto, Japan). Celler från stabila kloner eller med transient transfektion pläterades in i varje brunn på en 96-brunnarsplatta och 10 ul CCK-8 sattes till 90 ul odlingsmedium vid den angivna tiden. Därefter inkuberades cellerna vid 37 ° C under 2 timmar och den optiska densiteten mättes vid 450 nm. Enligt korrelationen mellan absorbansen och celltalet beräknades cellantalet baserat på absorbansen. För kolonibildningsanalysen ympades celler från stabila kloner i triplikat i 60 mm skålar (Corning, Corning, NY, USA) vid 800 eller 1000 celler per skål och inkuberades vid 37 ° C under 2 veckor. Kolonier fixerades med metanol, färgades med 0, 1% kristallviolett visualiserade och räknades sedan under mikroskopi. För analysen av mjukagar-kolonibildningen togs celler från stabila kloner från plattorna genom trypsinisering och resuspenderades sedan som individer i DMEM-tillväxtmedium med de fulla tillskotten blandade i ett 3: 1-förhållande med 1, 6% agaros (Amresco, Solon, OH, USA). Blandningen pläterades sedan på sex-brunnars plattor vid 500 celler per brunn över ett bottenskikt av 0, 8% agaros i DMEM med tillskotten. Cellerna hölls vid 37 ° C med en medium förändring var tredje dag. Tre veckor senare räknades cellaggregat med diametrar av 0, 2 mm eller större (innehållande ~ 50 eller fler celler) som kolonier.

Cell migration och invasion analyser

Wound-healing and transwell migration assays were performed to evaluate cell migration in HepG2 and Huh7 cells with transient transfection and L02 cells from stable clones. When cultured cells reached 90% confluence, they were scratched with a pipette tip and cultured in serum-free medium. Recovery of the disruption was observed for 0, 24 and 48 h. For transwell migration assay, cells were plated on the upper surface of the transwell chamber (Corning) and incubated for 24 h. The migrated cells at the lower surface of the chamber were fixed with 75% methanol and stained with crystal violet (Sigma, St Louis, MO, USA). Invasion assays were observed using a modified transwell chamber system (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) according the manufacturer's protocols. Cells from stable clones were seeded onto matrigel-coated membrane inserts with a pore size of 8 μm. Medium containing 10% fetal bovine serum served as the chemoattractant in the lower chamber. The invasive cells attached to the lower surface of the chamber after 48-h incubation were fixed with 75% methanol and stained with 0.1% crystal violet, and counted under a microscope.

Cellcykelanalys

Cells were collected and fixed in 70% ethanol at 4 °C for 16 h and then stained with propidium iodide. The distribution of cells within each of the cell cycle compartments was measured using a Becton-Dickinson FACS Calibur machine (San Jose, CA, USA).

RNA-extraktion och omvänd transkription

Total RNA was prepared using the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA) following the manufacturer's protocol. For formalin-fixed paraffin-embedded samples, total RNA was extracted from 5–20 10-μm-thick sections using miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. The quantity and quality of the total RNA were evaluated using the NanoDrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Incorporated, Waltham, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. An amount of 1 μg of total RNA from each sample was reverse-transcribed to cDNA with PrimeScript reverse transcriptase reagent kit (TaKaRa, Dalian, China) according to the manufacturer's instructions.

Real-time qRT–PCR of mRNA and miRNA

Quantitative real-time PCR was carried out in ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) using SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) according to the manufacturer's instructions. The miRNA sequence-specific RT–PCR for miR-372/miR-373/miR-106b/miR-93/miR-520a and endogenous control U6 was performed according to Hairpin-it miRNAs, qPCR quantitation kit and U6 snRNA real-time PCR normalization kit (GenePharma). All qPCR reactions, including no-template controls, were performed in triplicate. Expression levels of each mRNA or miRNA were evaluated using comparative threshold cycle (Ct) method as normalized to that of GAPDH or U6 (2 −ΔΔCT ). The sequences for primers were provided in Supplementary Table S2.

Western blotting and co-IP

Total protein was extracted from cells in the logarithmic growth phase. Cells were lysed and sonicated in a solution containing 0.5% sodium deoxycholate (w/v), 0.2% SDS (w/v), 1% Triton X-100 (v/v), 5 mm EDTA, 10 mg/ml leupeptin, 10 mg/ml aprotinin and 1 mm phenylmethyl sulfonyl–uoride supplemented with 1:1000 dilution of protease inhibitor cocktail. The homogenates were then centrifuged at 4 °C for 10 min to remove cell debris. Supernatants were collected and concentrations were determined by the DC protein assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Equivalent amounts of protein were electrophoresed on an 8% polyacrylamide gel and then transferred to a polyvinylidene difluoride membrane. For western blotting, the membrane was blocked with 5% milk (w/v) in TBS containing 0.1% Tween 20 (TBS/T) at room temperature for 2 h and incubated with primary antibodies including ANCCA/PRO2000 (1:1000), E2F2 (1:1000), ERO1L (1:1000) and G3BP2 (1:2000) overnight at 4 °C, washed three times with TBST, followed by incubation with appropriate secondary antibodies at room temperature for 1 h. The immune complexes were detected by an enhanced chemiluminescence system (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). For co-IP, protein extracts (0.2 mg) were incubated with anti-E2F2, anti-ERO1L or anti-G3BP2 antibody overnight at 4 °C. Subsequently, antibodies were collected with protein A-/protein G-Sepharose beads, and protein complexes were washed three times at 4 °C with the lysis buffer, electrophoresed on an SDS–polyacrylamide gel under reducing conditions, and transferred onto polyvinylidene difluoride membrane. Immunoblotting was incubated with the indicated primary antibody ANCCA/PRO2000 overnight at 4 °C and followed by incubation with appropriate horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody at room temperature for 1 h, and developed with enhanced chemiluminescence reagents.

cDNA expression array

Human genome oligo array (22 K) was designed by CapitalBio Corporation (Beijing, China). CapitalBio 22 K Human Genome Oligo Array comprises 21 522 70-mer oligo probes, each representing one transcript of the human genome. RNA samples as prepared above were labeled with Cy5 (red) and Cy3 (green) dyes, respectively. Labeled samples were then hybridized to array gene chips. Arrays were scanned using CapitalBio's confocal scanner LuxScan 10 KA (Beijing, China) and the obtained images were analyzed with SpotData software (CapitalBio). An intensity-dependent lowess program in the R language package was used to normalize the two channel ratio values.

3′-UTR luciferase reporter assay

For luciferase reporter experiments, the wild and mutational 3′-UTR segments of ANCCA/PRO2000 predicted to interact with miR-372 were amplified by PCR from human genomic DNA and inserted into psiCHECK2 vector immediately downstream from the stop codon of luciferase (Promega, Madison, WI, USA) to develop psiCHECK2-ANCCA/PRO2000-3′UTR and psiCHECK2-ANCCA/PRO2000-mut-3′UTR. HepG2 cells were transfected with 0.4 μg of the luciferase reporter psiCHECK2 control, 0.5 μg psiCHECK2-ANCCA/PRO2000-3′UTR constructs or psiCHECK2-ANCCA/PRO2000-mut-3′UTR. Co-transfection of miR-372 mimics or inhibitors at 100 nm was also performed in HepG2 cells. Luciferase activity was measured by the dual-luciferase assays (Promega) and the data were showed in Supplementary Figure S1.

In vivo tumor xenograft model

Female BALB/c nude mice aged 6–8 weeks were purchased from the Guangdong Laboratory Animal Center, China (National certification No. 2006A015). All procedures were performed according to the guidelines of Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. HepG2, Huh7 or L02 cells from stable clones were collected, washed with PBS and resuspended in serum-free medium at a concentration of 1 × 10 7 cells per 0.2 ml. Twenty-four mice were randomly divided into three groups for HepG2 (shANCCA/Ctrl), Huh7 (shANCCA/Ctrl) and L02 (pcDNA3.1-ANCCA/pcDNA3.1) cells. We were single-blinded to the group allocation. Each subculturing situs was injected with viable 4 × 10 6 per 0.2 ml of HepG2 or Huh7 and 6 × 10 6 per 0.2 ml of L02 in the back leg to establish the cancer model, respectively. Tumor size was monitored every 3 days, and mice were killed after 4–5 weeks. The tumors were excised and measured. The tumor volume ( V ) was calculated using the following equation: V =1/2 × S 2 × L , where S and L are the shortest and longest diameter of the tumor, respectively.

Immunohistokemisk färgning

Sections were deparaffinized and rehydrated routinely. Before adding the primary antibody, antigen was retrieved by heating sections in 10 mm citrate buffer (pH 6.0) in a microwave oven for 10 min, followed by 10 min of cooling. After blocking with 0.3% H 2 O 2 and goat serum, the slides were then incubated with a primary antibody, directed against ANCCA/PRO2000 (1:100 dilution) and E2F2 (1:50 dilution; Santa Cruz Biotechnology Inc) at 4 °C overnight. Biotinylated secondary antibodies were then applied according to the manufacturer's recommendations (Amersham). After incubation with avidin–biotin complex using the Vector Elite ABC detection kit (Vector Labs, Burlingame, CA, USA), reaction products were visualized by 3-diaminobenzidine, and the slides were subsequently counterstained with hematoxylin. Brown-yellow granules in the nucleus or cytoplasm were considered positive staining. The positive reactivity was scored semiquantitatively by microscopic evaluation according to the estimated number of positive nuclei or cytoplasm of target cells. The scores were graded into four groups from 0 to +3 as follow: 0, no positive cells; +1, 50% of positive cells. Negative controls were performed by replacing the primary antibodies stated above with PBS. Image quantitative analysis was performed using Image ProPlus 6 AMS software (Media Cybernetics Inc, Buckinghamshire, UK). ANCCA/PRO2000 and E2F2 expression intensity was assessed by estimating the integrated optical density.

Statistisk analys

Data are represented as mean±sd Possible differences between the groups were analyzed using independent samples T- test or one-way analysis of variance. The association between ANCCA/PRO2000 expression and clinical features were analyzed by Pearson χ 2 -test. Survival curves were obtained by Kaplain–Meier analysis. Prognostic factors were examined by univariate and multivariate analyses (Cox proportional hazards model). A P- value <0.05 was considered significant. All statistical analyses were carried out using SPSS 17.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur S1

  2. 2.

    Kompletterande figur S2

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

  2. 2.

    Kompletterande tabeller

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på Oncogenesis webbplats (//www.nature.com/oncsis)