Agglutinerande mus igg3 jämförs gynnsamt med igms vid typ av blodgrupp b-antigen: funktionalitets- och stabilitetsstudier | vetenskapliga rapporter

Agglutinerande mus igg3 jämförs gynnsamt med igms vid typ av blodgrupp b-antigen: funktionalitets- och stabilitetsstudier | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Tillämpad immunologi
  • Analyssystem

Abstrakt

Musimmunoglobuliner M (IgM) som känner igen antigen från humana blodgrupper inducerar hemagglutination och används över hela världen för diagnostisk blodtypning. I motsats till den nuvarande uppfattningen att IgGs är för små för att samtidigt binda antigen på två olika erytrocyter, erhöll vi agglutinerande mus-IgG3 som kände igen antigen B i det mänskliga ABO-blodgruppssystemet. Mus IgG3 är en spännande isotyp som har förmågan att bilda Fc-beroende oligomerer. F (ab ′) 2- fragment av IgG3 var emellertid tillräckliga för att agglutinera röda blodkroppar av typ B; därför krävde IgG3-triggad agglutination inte oligomerisering. Molekylär modellering indikerade att mus IgG3 har ett större intervall av Fab-armar än andra mus-IgG-underklasser och att de unika egenskaperna hos mus-IgG3 troligen beror på strukturen i dess gångjärnregion. Med fokus på applikationer inom diagnostik jämförde vi stabiliteten hos IgG3 och två IgM i formulerade blodtypsreagens med hjälp av en accelererad lagringsmetod och differentiell skanningskalorimetri. IgG3 var mycket mer stabilt än IgM. Intressant nog orsakades den snabba minskningen i IgM-aktivitet av aggregering av molekylerna och en tidigare okänd posttranslational proteolytisk bearbetning av den tunga kedjan. Våra data pekar på mus IgG3 som ett potent diagnostiskt verktyg.

Introduktion

Trots många års forskning inom immunoglobuliner förblir vissa aspekter av antikroppsbiologi oförklarliga. Det finns en enorm mängd information om strukturen och funktionerna hos humana immunoglobuliner, varvid dessa data mestadels samlas in under uppfinningen av antikroppsbaserad terapeutik. Däremot är musimmunoglobuliner mindre karaktäriserade, även om deras användbarhet vid forskning, diagnostik och generering av genetiskt konstruerade chimära och humaniserade terapeutiker är obestridlig 1 . Betydande skillnader mellan antikroppar från människa och mus är tydliga i funktionerna och egenskaperna hos IgG-underklasserna som finns i dessa två arter 2 . Även om det är lika med namnet, utvecklades mus- och mänskliga IgG-underklasser efter skillnaden mellan gnagare och primitiva utvecklingslinjer 3, 4 ; sålunda är egenskaperna hos humana och mus-IgG inte utbytbara.

Bland fyra underklasser av mus-IgG: IgG1, IgG2a, IgG2b och IgG3, är den minst karakteriserade IgG3-isotypen. IgG3 har den lägsta mängden bland IgG i musserum. Ökade nivåer av IgG3 har rapporterats efter immunisering med polysackarider 5 och vid autoimmuna störningar, t.ex. i musmodellen för systemisk lupus erythaematosus 6 . I allmänhet kan mus IgG3: er interagera med varandra via Fc-fragment i frånvaro av kognatantigen 7, 8 . Denna interaktion är mycket svag, med en KD på ungefär 10 - 4 M 9, men dess styrka kan ökas genom att binda vissa antigener, särskilt multivalenta antigener 10 . Den exceptionella förmågan hos IgG3-molekyler att bilda icke-kovalenta oligomerer är relaterad till deras kryoglobulinaktivitet. Kryoglobuliner är plasmaproteiner som fälls ut reversibelt vid låga temperaturer 11 . Närvaron av kryoglobuliner i serum är starkt korrelerad med autoimmuna störningar 6 . I musmodeller av autoimmunitet kan IgG3-innehållande immunkomplex framkalla njursjukdom och kan till och med leda till dödsfall på grund av akut njursvikt 12, 13 . Strait et al . 14 visade nyligen att IgG1 kan skydda mot avsättning av patologiska antigen-IgG3-antikroppskomplex i glomerulära kapillärer 14 .

Här undersökte vi en annan unik egenskap hos mus IgG3s som är specifika för antigen B från det mänskliga ABO-blodgruppssystemet. Vi upptäckte att de IgG3 som erhölls i vårt laboratorium inducerade agglutination av erytrocyter. Denna förmåga har tidigare tillskrivits endast oligomera IgM, i vilka avståndet mellan de två längsta antigenbindande platserna är 35 nm 15 . IgM inducerar hemagglutination mycket starkt och effektivt eftersom det lätt kan binda antigener på två olika erytrocyter och bilda cellaggregat. Enligt det nuvarande kunskapstillståndet kan IgG inte agglutinera röda blodkroppar 16 . Området för de antigenbindande ställena för IgG överskrider inte 15 nm 17 och är mindre än minimiavståndet mellan två erytrocyter under fysiologiska förhållanden. Därför antas det att IgG: erna helt enkelt är för små för att inducera hemagglutination.

I motsats till denna allmänt accepterade uppfattning visade vi att mus IgG3 inducerar hemagglutination med liknande effekt som IgM. Funktionerna hos mus-IgG3-struktur som sannolikt är ansvariga för denna förmåga analyserades. Vi utvärderade också användbarheten av IgG3-baserade reagens för blodtypning och jämförde stabiliteten för IgG3 och IgM i formuleringar som används i serologisk diagnostik. Stabilitetsstudierna avslöjade en ny, proteasberoende, post-sekretionsbehandling av mus-IgM. Däremot underkastades IgG3 inte denna process och kan tjäna som ett mer stabilt serologiskt reagens.

Resultat

Unik M18-antikropp som kan agglutination av röda blodkroppar

Vi använde hybridomtekniken för att generera biosimilar reagens lämpliga för serologisk diagnostik. Splenocyterna från tre möss immuniserade med röda blodkroppar från grupp B (RBC) användes för fyra oberoende fusioner. Media som samlats in från kulturer av alla erhållna hybridomkloner screenades med avseende på närvaro av antikroppar med användning av glidagglutinationstester med RBC av grupp A, B och O. Antigener i ABO-blodgruppssystemet är små en-epitopoligosackarider (kompletterande figur 1 18) Vi erhöll totalt 20 kloner som producerade agglutinerande anti-B-antikroppar (tabell 1), och för alla kloner sekvenserades cDNA: er som kodade för variabla regioner. Analysen avslöjade att alla de specifika klonerna som genererades genom odödlighet av splenocyter härrörande från en enda RBCs-immuniserad mus producerade exakt samma antikropp (tabell 2). Genom att immunisera tre möss erhöll vi därför tre olika antikroppar, M18, O10 och Q6, som var specifika för B-antigenet i ABO-blodgruppssystemet. Vi förväntade oss att alla antikroppar som erhållits skulle vara av IgM-klass eftersom endast IgM anses ha kapacitet till RBC: s agglutination i saltlösning 16 . I själva verket var två av antikropparna, O10 och Q6, IgMK respektive IgM X. Oväntat var den tredje antikroppen, M18, av IgG3-isotypen. Dessutom verkade denna IgG3-antikropp affinitetsmognad, och uppvisade ett stort antal aminosyrasubstitutioner jämfört med könssekvensen. Figur 1 visar en fullständig sekvens av den variabla regionen M18 (V) och dess molekylmodell. Både aminosyrasekvensen och strukturen avviker inte från en typisk mus-IgG3-molekyl. Cellodlingsmediet innehållande M18-antikroppen inducerade en stark och snabb agglutineringsreaktion, i motsats till det agglutinerande antikroppsparadigmet. Således beslutade vi att undersöka M18 ytterligare och jämföra dess egenskaper med IgM som för närvarande används i serologi.

Full storlek bord

Full storlek bord

Image

( a ) V-regionsekvenser av M18. ( b, c ) Modell av M18 V-regionen komplex med dess kognata antigen, blodgrupp B-trisackarid (röd). En molekylär yta som bildas av CDR: er färgas med samma nyanser som i del a. Antigenet anordnades i ett spår bildat av CDR, där aminosyrarester involverade i interaktionen med antigenet troligen är närvarande. ( c ) Antigen i M18-bindningsställe. Den terminala galaktosen, unik för antigen B, indikeras.

Bild i full storlek

IgG3-inducerad hemagglutination beror på IgG3-konstanten

Som beskrivits ovan isolerade vi en IgG3 med förmåga till RBC-agglutination. Denna förmåga kan vara resultatet av strukturen i M18 V-regionen, i vilket fall den skulle vara begränsad till denna specifika antikropp, eller från strukturen i dess konstant region, i vilket fall den skulle representera ett allmänt drag i IgG3-musklassen. För att undersöka vilken del av antikroppen som var ansvarig för agglutineringsegenskapen, klonade vi V-regionerna i två agglutinerande antikroppar, M18 IgG3 och O10 IgM, till kommersiella mus-IgG1- och IgG3-ramverk (fig. 2a). Alla de nyligen erhållna antikroppsvarianterna behöll förmågan hos föräldrarmolekyler att binda antigenet (kompletterande figur 2). Medier uppsamlade från kulturer av HEK293-celler som uttrycker antikroppar eller saltlösningar av renade immunoglobuliner blandades försiktigt med en 0, 45% (hematokrit) suspension av grupp B-erytrocyter under 20 minuter. Agglutination utvärderades med användning av ett mikroskop. M18_IgG3 och O10_IgG3 agglutinerade erytrocyter, medan IgG1-switchvarianterna av dessa antikroppar inte inducerade hemagglutination (fig. 2b, c).

Image

( a ) Ritningen visar schematiskt kloning av variabla fragment till IgG3- och IgG1-ramverk. ( b ) IgG1 och IgG3 med samma variabla fragment jämfördes med avseende på deras förmåga att agglutinera erytrocyter. Antikroppskoncentration i det analyserade cellodlingsmediet bestämdes med användning av ELISA. Representativa resultat från tre oberoende experiment. Skalstång –100 μm. ( c ) Eftersom O10_IgG3 var mindre effektiv i hemagglutination än M18, upprepades experimentet som presenterades i b med användning av högre koncentration av renade O10_IgG3- och O10_IgG1-antikroppar. Representativa resultat från två oberoende experiment. Skalstång –200 μm. ( d ) EC 50 för antikroppsbindning till immobiliserade RB: er av typ B. Datapunkter representerar medelvärden erhållna för triplikat av analyserade prover. Experimentet utfördes två gånger. EC50 för M18_IgG3 var ungefär tre gånger lägre än EC 50 för O10_IgG3 i båda repetitionerna.

Bild i full storlek

Agglutination utlöst av O10_IgG3 var svagare än M18_IgG3. Eftersom EC 50 för M18_IgG3-bindning till immobiliserade RB: er av typen B var signifikant lägre än O10_IgG3 berodde denna skillnad troligt på skillnader i affiniteten hos dessa antikroppar gentemot ett-epitop B-antigenet (fig. 2d). Denna effekt är inte förvånande med tanke på att O10_IgG3 innehöll det variabla fragmentet av det icke-affinitetsmogna IgM, medan M18 troligen genomgick affinitetsmognad (tabell 2).

Sammantaget antyder dessa resultat att förmågan att inducera hemagglutination är ett generellt drag hos IgG3-mus från mus som känner igen antigen som finns på erytrocyter.

M18-inducerad agglutination är inte beroende av Fc-fragmentet

Mus-IgG3-antikroppar har en förmåga, exceptionell bland murina IgG, att svagt interagera genom deras Fc-fragment och att bilda oligomerer på antigenbindande 6, 9, 19, 20, 21 . För att analysera om Fc-fragmentet är avgörande för den agglutinerande förmågan hos IgG3, avlägsnade vi Fc-delen av M18 via pepsin-matsmältning. Den enzymatiska klyvningen resulterade i ett mycket rent tvåvärt F (ab ') 2- fragment av M18 (fig. 3a, b). Det erhållna M18-antikroppen F (ab ') 2- fragmentet bibehöll förmågan att agglutinera RBC: er (fig. 3c), vilket indikerar att agglutineringsförmågan hos M18 inte beror på dess Fc-fragment.

Image

( a - c) RBC: s agglutination inducerad av F (ab ') 2 av M18-antikropp. ( a ) Pepsin-digerering avlägsnar Fc-fragmentet från IgG-molekylen, vilket resulterar i F (ab ') 2 . ( b ) Renhet av M18 och dess F (ab ′) 2 . En intakt IgG-antikropp under reducerande förhållanden migrerar som två band motsvarande tung kedja (HC, ungefär 50 kDa) och lätt kedja (LC, 25 kDa). HC 'är en tung kedja smält med pepsin. F (ab ′) 2 är ett protein med en molekylmassa av ungefär 120 kDa, vilket bekräftades av SDS-PAGE och western blotting under icke-reducerande betingelser. Prover i western blotting undersöktes med anti-mus-Ig-antikropp. IgG under icke-reducerande förhållanden migrerar som två eller tre band. En liten mängd Fab genereras oundvikligen under pepsin-matsmältningen. ( c ) Hemagglutination av erytrocyter från grupp B inducerad av mus-IgG3-härledd F (ab ') 2, vehikelbuffert och intakt förälder M18-antikropp. ( b, c) är representativa resultat från fem oberoende experiment. ( d ) Molekylär modellering av gångjärnregionen i M18-isotypvarianter. För varje isotyp anges ett avstånd mellan alfakol i den första gångjärnets aminosyra och alfakol i den första cysteinrest som är involverad i den mellan tunga kedjan disulfidbindningen. Sekvensen för det övre gångjärnsområdet presenteras för varje subtyp i rött. För tydlighetens skull presenterades bara en tung kedja. Modellerna av varianterna M18 IgG1, IgG2a och IgG3 genererades med C-poäng större än 0, 9, vilket indikerar hög förtroende hos de förutsagda modellerna. C-poäng beräknat för M18 IgG2b-modellen var något lägre och nådde 0, 5 på grund av brist på en fullständig mus-IgG2b-struktur i PDB-databasen som kunde användas som en mall i modelleringsalgoritmen.

Bild i full storlek

Den unika gångjärnregionen för IgG3 ökar intervallet mellan antigenbindningsställen - i silikostudier

När vi uteslutte Fc-fragmentets roll i den IgG3-inducerade agglutinationen fokuserade vi på F (ab ') 2- fragmentet av M18-antikroppen. Den tunga kedjan av M18-härledd F (ab ') 2, som bibehåller förmågan att agglutinera, består av V-regionen, CH1-domänen och ett gångjärnsområde. Vi antog att F (ab ′) 2 innehåller ett motiv, unikt för IgG3, som sträcker sig över de antigenbindande platserna. För att undersöka om IgG3 avviker från andra mus-IgG-underklasser i detta avseende utförde vi multipla sekvensinriktning av M18 IgG3 och M18 modellerade som IgG1, IgG2a och IgG2b isotypvarianter (kompletterande figur 3). Analysen avslöjade att de största skillnaderna mellan mus-IgG-underklasser är i gångjärnsregionen. IgG3 har ett utomordentligt långt övre gångjärn, som gränsar till det första gångjärnets aminosyra och en cystein, och bildar den första mellan tunga kedjedisulfidbindningen 22 . För att analysera hur skillnader i de övre gångjärnslängderna mellan mus IgG-subtyper påverkar det teoretiska området för antigenbindande platser, genererade vi modeller av M18-isotypvarianter med jämförande molekylmodellering. Modellerna indikerade att det övre gångjärnet på IgG3 är 1–2 nm längre än i andra isotyper (fig. 3d). Om man antar att Fab-delen av en antikropp har en konstant storlek bör intervallet för antigenbindningsställen endast bero på den övre gångjärnslängden. Baserat på två antaganden: ( i ) en immunoglobulinmolekyl har en plan konformation och ( ii ) vinkeln mellan Fab-fragmenten varierar från 90 ° till 120 ° 23, indikerar i silikoanalys att intervallet av antigenbindningsställen i en tvåvärd IgG3 molekylen kan vara 2, 8–3, 4 nm längre än i andra subtyper. Denna strukturella egenskap förklarar sannolikt IgG3s unika förmåga att agglutinera erytrocyter.

Jämförelse av IgG3 och IgM som diagnostiska reagens

Därefter jämförde vi nyttan av IgG3 och IgM vid blodtypning. Hybridomceller ympades med en densitet av 5 x 104 celler / ml och odlades under 72 timmar. Antikroppskoncentrationerna i media som samlats in från kulturerna och motsvarande antikroppstitrar (som utvärderades genom glidagglutination; se avsnitt om material och metoder: "RBC och agglutination") var följande: 29 μg / ml och 64; 6 μg / ml och 16; och 15 μg / ml och 32 för kloner som producerar M18 (IgG3), O10 (IgM) respektive Q6 (IgM). Specificiteten för de erhållna antikropparna analyserades med användning av många nyligen donerade humana blodprover av förutbestämda blodgrupper (tabell 3). Varje antikropp testades också i ett indirekt antiglobulintest och i agglutination av papainbehandlade RBC: er. Negativa resultat erhölls konsekvent när grupp A- eller O-blodprov analyserades. Det är viktigt att M18, O10 och Q6 effektivt agglutinerade RBC: er från gravida kvinnor och nyfödda (data har inte presenterats). Sådana RBC: er kan ha minskade nivåer av ABO-antigen 18 . För att erhålla antikroppspreparat med titrar som är jämförbara med de för kommersiellt tillgängliga blodgruppsreagens, producerade vi antikropparna med användning av engångs-bioreaktorer. Medierna som samlats in från kulturerna i bioreaktorer efter cellseparation och komplettering med buffertar och konserveringsmedel gav diagnostiska reagenser av hög kvalitet, som inducerade agglutination inom 5–10 s och nådde agglutineringsresultat så högt som 4+ inom 1 minut efter kontakt mellan reagenset och ett blodprov. Glidagglutinationstitrar av M18-, O10- och Q6-baserade reagens var 256, 512 respektive 128.

Full storlek bord

Vi jämförde också agglutinationskapaciteten för IgG3 och IgM: er (Tabell 4). Tre nanomolära lösningar av M18, O10 och Q6-antikroppar i saltlösning utspäddes seriellt och blandades med en 0, 45% (hematokrit) suspension av RBC. Efter 20 min inkubation utvärderades resultaten med användning av ett faskontrastmikroskop. Vi antog att IgM: erna pentamerer med en molekylmassa av cirka 970 kDa. Detta antagande gjordes på grund av att ( i ) uttrycket av J-kedjan gynnar sekretionen av pentameriska IgM: er 24 ; och ( ii ) de analyserade hybridomen, såväl som Sp2 / 0-myelom (fusionspartner), uttryckte J-kedja (kompletterande figur 4). Med avseende på IgG3- och IgM-agglutinationskapacitet observerades agglutinationskår på 1+ i närvaro av 4-7 gånger fler M18-molekyler än för de två analyserade IgM: erna (tabell 4). IgGs molekylmassa är ungefär 6 gånger mindre än för IgM: er; sålunda krävs liknande mängder (i massa) av specifikt IgG3 och IgM för att framkalla samma grad av agglutination.

Full storlek bord

För att verifiera om det IgG3-baserade reagenset kan vara mer lönsamt än IgM-baserade reagens, bestämde vi produktiviteten och fördubblingstiderna för klonerna som producerade M18, O10 och Q6 antikroppar. IgG3 producerades ungefär tre gånger mer effektivt än IgM: er (kompletterande figur 5). De tre analyserade cellinjerna uppvisade liknande fördubblingstider (kompletterande figur 5); följaktligen beror den totala antikroppsutbytet primärt på cellinjeproduktiviteten.

Stabilitet av IgG3- och IgM-baserade reagens

Monoklonala reagens som används i serologi, snarare än att vara renade antikroppar, filtreras vanligtvis och buffras medier som samlas in efter bio-process med matad sats. Reagensen kompletteras ofta med konserveringsmedel och medel som förbättrar agglutination. För att jämföra stabiliteten hos IgG3- och IgM-baserade reagens beredde vi enkla formuleringar av M18, O10 och Q6-antikroppar genom buffring av odlingsmediet med 20 mM Tris-HCl pH 7, 5 och tillsats av 0, 01% tiomersal. För att påskynda eventuella förändringar i deras aktivitet som kan uppstå under lagring använde vi den klassiska proceduren för att hålla formuleringarna vid 42 ° C under 7 dagar 25, 26 . Provernas aktiviteter testades dagligen via glidagglutineringsanalyser (tabell 5). IgM-antikroppar förlorade sin förmåga att agglutinera snabbare än IgG3. IgM började förlora sin funktionalitet efter 24–48 timmar vid 42 ° C. Däremot var IgG3 M18 stabil under minst 5 dagar vid 42 ° C. Resultaten överensstämde med vår tidigare observation att IgM, men inte IgG3, relativt snabbt förlorar sin aktivitet även när de lagras vid rumstemperatur. Dessutom kunde O10 och Q6 inte frysas och tinas utan att tappa aktivitet, i motsats till M18, som behöll full aktivitet även efter 10 cykler med frys-tining (data inte presenterade). Även om den låga stabiliteten för IgM är välkänd 27, 28, förblir de molekylära mekanismerna som är ansvariga för den snabba förlusten av dess aktivitet oklara. Således undersökte vi den molekylära basen för IgM-instabilitet. Först använde vi western blotting för att analysera proverna som samlades in under den accelererade lagringsstudien. Såsom presenterats i fig. 4a, under lagring vid 42 ° C, ( i ) genomgick den tunga kedjan i trunkeringen i de IgM-baserade reagensen, vilket resulterade i en mikrometer kedja med en molekylmassa av cirka 55 kDa; och ( ii ) icke-reducerbara aggregat bildades i de IgM-baserade reagensen. Båda förändringarna ökade med tiden. För att bestämma om bildningen av trunkerad μ ′-kedja är en direkt kemisk eller enzymmedierad process, inkuberade vi prover av fem olika IgM, formulerade som beskrivits ovan, med en proteasinhibitorcocktail (fig. 4b). Inhibitorerna förhindrade ökningen i nivåerna av μ ′-kedjor men främjade bildandet av både reducerbara och icke-reducerbara aggregat (fig. 4b, nedre panel). Därefter frågade vi om proteaserna involverade i μ-kedjetrimning härstammade från själva hybridomceller eller härrörde från FBS. Det senare var fallet. Specifikt förblev renade IgMs intakta under lagring vid 4 ° C eller 42 ° C men trimmades i närvaro av FBS (fig. 4c). Trunkeringen var ännu mer uttalad när FBS ersattes med en ekvivalent mängd bovint albumin från serum, vilket erhölls genom värmebehandling (ht-BSA). Även om reagenset antas innehålla primärt albumin, berikas det också i många andra proteiner, vilket visas i tilläggsfigur. 6. Proteaset av intresse troligtvis fälls ut med albumin under fraktioneringen av serumet. Den observerade signifikanta ökningen av IgM-proteolys efter ersättning av FBS med BSA kan också vara resultatet av avlägsnandet av stora plasmaproteinasinhibitorer, såsom a-1-antiproteinas och a-2-makroglobulin under FBS-fraktionering. Vi analyserade också om avkortningen av μ-kedjan inträffar i musserum. Vi observerade en ökning i μ ′ kedjanivåer efter inkubation av musserumprover vid 42 ° C under 4 dagar (Fig. 4e). Detta resultat indikerar att proteaset som trimmar μ-kedjan inte bara finns i bovint serum utan också i artskompatibelt musserum och antyder att denna mekanism för IgM-instabilitet troligen kommer att inträffa in vivo .

Full storlek bord

Image

Alla prover undersöktes med HRP-märkta anti-mus-IgM-k polyklonala antikroppar. ( a ) O10- och Q6-baserade reagens inkuberades vid 42 ° C under 6 dagar. Mängden avkortad tung kedja (μ ′) ökade i efterföljande prover som tagits dagligen. Bilder är representativa för fyra oberoende experiment. ( b ) Proteasinhibitcocktail förhindrade trimning av en tung kedja, men främjade bildandet av både reducerbara och icke-reducerbara disulfidbaserade aggregat. Mängden IgM-aggregat med den höga molekylmassan ökade efter exponering för förhöjd temperatur. Representativa resultat från fyra oberoende experiment visas. Blottar i ( b ) presenterar samma prover upplöst under reducerande och icke-reducerande betingelser. HC - tung kedja, LC - lätt kedja. ( c ) Proteas (er) närvarande i serumtrim (er) den IgM tunga kedjan. Renade IgM-antikroppar inkuberades med 5% FBS eller ht-BSA (1, 5 mg / ml) under 4 dagar vid angivna temperaturer. Stapeldiagrammet visar relativa mängder av trunkerad tung kedja kvantifierad med densitometri. Intensiteten för ett band som motsvarar μ ′-kedjan i kontrollprovet utan tillsats inkuberat vid 4 ° C definierades som 1. μ ′-kedjan i prover med tillsatser migrerar något snabbare än i kontroll, förmodligen på grund av närvaron av den stora band av serumalbumin, vilken molekylmassa är ungefär 66 kDa. Diagrammet visar medelvärden härrörande från två separata blott framställda från samma prover i ett experiment. Resultaten i ( c ) är representativa för två oberoende experiment. ( d ) Trunkering av μ-kedjan sker i musserum. Prover av musserum inkuberades parallellt vid 4 och 42 ° C under 4 dagar. Figuren visar ett resultat som erhållits för ett serumprov som representerar tre av fyra analyserade prover som samlats in från olika möss (i ett prov var nivåerna av μ′ lika vid 4 ° C och 42 ° C).

Bild i full storlek

För att ytterligare karakterisera skillnaderna i stabiliteten hos IgG3 (M18) och IgM: er (O10 - hemmagjord och MM30 - kommersiell) och för att undersöka om lagring av formuleringarna påverkar stabiliteten hos immunoglobulinerna utförde vi differentiell skanning kalorimetrisk (DSC) analyser. DSC mäter entalpin av proteinutveckling som är resultatet av termisk denaturering. För små proteiner med en domän, består termogrammer som visar ett beroende av den molära värmekapaciteten för denaturering (cp) på temperaturen vanligtvis av en enda värmeabsorptionstopp. Maximumet för denna topp, betecknad Tm, är den termiska övergångsmittenpunkten och definieras som temperaturen där 50% av proteinet befinner sig i dess ursprungliga konformation och resten denatureras. Ju högre Tm, desto stabilare är proteinet. För multidomainproteiner, såsom immunglobuliner, återspeglar emellertid termogrammen en denatureringsprocess med flera tillstånd och är mer komplexa. Denna komplexitet härrör från sammanslagningen av överlappande toppar som representerar de termiska övergångarna för enskilda domäner. Området under kurvan, dvs integralen av den molära värmekapaciteten, är lika med den kalorimetriska förändringsförändringen (ΔH cal ), vilket återspeglar energin som krävs för total proteinutveckling.

Prover av antikropparna som lagrades under 5 dagar vid 4 ° C (kontroll) eller 42 ° C underkastades DSC-analyser (fig. 5a). För varje antikropp resulterade kontrollsökningar och upphettade prover i termogrammen med en liknande totalform och AH- kal . Maxima (Tm) för de monterade skala övergångarna med två tillstånd var desamma för kontroll och uppvärmda prover men skilde sig åt för varje antikropp. Termogrammet för M18 sönderdelades i tre överlappande toppar, som troligen motsvarade CH2 ( Tm1 = 62, 5 ° C), CH3 (T m2 = 71 ° C) och Fab (T m3 = 74, 5 ° C) övergångar 29 . För O10 bestod termogrammet av två övergångar med Tm1 = 66 ° C och T m2 = 73, 5 ° C. Bidragen från den första och den andra övergången till den totala ΔH kal som observerades för kontrollen, icke uppvärmd O10, var 59% respektive 41%. Fab-fragmenten svarar för cirka 57% av den pentameriska IgM-massan (exklusive N-glykaner), medan de återstående 43% är massan för Fc-fragmentet. En konsistens mellan Fab: Fc-massproportionen i en fullständig IgM och det relativa bidraget från de separata övergångarna i O10-termogrammet antyder att Fab-domänutviklingen föregår Fc-fragment som utvecklas i denna molekyl. Även om det uppvärmda O10 uppmättes den uppmätta AH- cal liknade kontrollproven, såg vi en förskjutning i de relativa bidragen för separata övergångar (Fig. 5b). Skanningar av MM30-proverna visade breda termogram, med minst tre överlappande övergångar. O10 och MM30 är båda av IgM-klassen, men de analyserade MM30-proverna innehöll många fler trunkerade tunga kedjor än O10-beredningarna (Fig. 5c). Vi beräknade Fab: Fc-massproportionen för MM30 med hänsyn till mängden av den avkortade tunga kedjan. En direkt jämförelse mellan andelen och ett bidrag från passningarna till ΔH cal tillät oss inte att avgöra vilka övergångar som motsvarar specifika domäner i MM30-antikroppen.

Image

( a) DSC-termogram av M18-, O10- och MM30-prover lagrade vid 4 ° C samt upphettade vid 42 ° C under 5 dagar. Svarta massiva linjer representerar experimentella data, som sedan var utrustade med den tvåstatiga skalade modellen tillhandahållen av TA Instruments (grå streckade linjer). Prickade linjer är summan av passningarna. Maxima för passningarna (T m ) indikeras. Uppnådda Tm-värden var desamma för både kontroll- och upphettade prover av antikropparna. ( b ) Bidrag från de två separerade övergångarna av O10-antikropp till total HH- kal . Diagrammet visar medelvärden från två oberoende experiment. ( c ) SDS-PAGE av MM30- och O10-prover analyserade med DSC. Andelen av trunkerad till full längd tung kedja i MM30-prover var ungefär 1: 3 (densitometrisk analys). Den trunkerade tunga kedjan var nästan odetekterbar i O10-prover.

Bild i full storlek

Sammanfattningsvis indikerade DSC-analyserna att stabiliteten för M18 IgG3 Fab-fragmentet är högre än för O10 IgM. Lagring av antingen antikropp under 5 dagar vid 42 ° C leder emellertid inte till uppenbara strukturella förändringar som kan återspeglas av DSC-profiler. Små förändringar i DSC-profiler observerades för O10 IgM men inte för M18 IgG3.

Musimmunisering med RBC leder till ökade serumnivåer av IgM och IgG3

För att bedöma om musen som var splenocytdonatorn för fusionen som genererade M18 hade en exceptionellt hög IgG3-serumnivå jämförde vi koncentrationer av IgM och IgG3 i denna mus och i flera andra immuniserade och icke-immuniserade möss (fig 6). Som förväntat hade alla immuniserade möss ökat både IgM- och IgG3-nivåer jämfört med kontroller; emellertid korrelerade inte serumnivåerna av speciella isotyper med isotypen av den specifika agglutinerande antikroppen som erhölls (tabell 2). Därför kan inte generering av agglutinerande IgG3 förutsägas på basis av IgG3- och IgM-koncentration i serum.

Image

Prover av musserum analyserades med användning av IgG3- och IgM-specifika ELISA. Prover från 11 olika möss vid åldern 25–29 veckor analyserades, bland vilka 5 djur immuniserades med RBC. Pilarna indikerar serumprov från musnr. 5, vars splenocyter användes i fusion vilket resulterade i M18-antikroppsgenerering. Agglutination bedömdes för prover utspädda 100 gånger. Felstänger motsvarar SD för koncentrationsmätningar.

Bild i full storlek

Diskussion

Mus IgG3 har ett unikt gångjärnsområde, som kan ligga till grund för dess agglutineringsförmåga

Atypiska egenskaper hos mus IgG3 har rapporterats sedan dess upptäckt 1971 8 . Bland mus-IgG: er kan endast IgG3 interagera (om än svagt) via deras Fc-fragment. Även om den uppskattade bindningskonstanten för den Fc-beroende interaktion mellan mus IgG3-molekyler är låg 9, verkar denna självassociation ha en enorm inverkan på deras egenskaper 7, 14, 20 . Betydelsen av Fc-fragmentet vid medling av IgG3s unika egenskaper fick oss att bestämma om detta fragment också är ansvarigt för den observerade agglutineringsförmågan hos IgG3. Oväntat bibehöll divalent F (ab ') 2 framställd genom pepsin-digerering av M18 agglutineringsförmåga, vilket tydligt indikerar att M18-inducerad hemagglutination inte beror på Fc-fragmentet. Vi framställde också rekombinanta IgG1- och IgG3-isotypvarianter av två agglutinerande antikroppar, M18 (IgG3) och O10 (IgM). Vi visade att IgG3 med variabla regioner härledda från M18 eller O10 bibehöll förmågan att agglutinera RBC, medan motsvarande IgG1-molekyler inte inducerade direkt hemagglutination. Resultaten indikerar att förmågan att tvärbinda erytrocyter är ett generellt drag hos IgG3 från mus, men inte IgG1. För att bestämma molekylmekanismen bakom IgG3-triggad hemagglutination fokuserade vi på det övre gångjärnet på antikroppen. Denna region bestämmer flexibiliteten hos en IgG-molekyl och påverkar indirekt dess effektorfunktioner 22 . Det övre gångjärnet i IgG3 från mus är det längsta av alla mus-, kanin- och humana IgG-övre gångjärn. Dessutom är gångjärnsregionen för mus-IgG3 stel, till skillnad från de flexibla gångjärnen hos andra IgG: er 22 .

I silikoanalys utfördes på modell M18-isotypvarianter och indikerade att intervallet för Fabs i IgG3 kan vara upp till 3, 4 nm längre än i andra isotyper. Men de faktiska skillnaderna i området för Fab-armarna för olika IgG-subtyper är svåra att fastställa. Previously published reports concerning Fab ranges in mouse and human IgGs showed that the distance between Fabs depends on the antibody molecule geometry and its flexibility 17, 23 . On the other hand, Sosnick et al . demonstrated that a functional Fab range does not directly correlate with the upper hinge length, eg, mouse IgG1 and IgG2b have similar range of Fab arms, approximately 134 Å 17, although the upper hinge of IgG2b is five amino acids longer than that of IgG1.

Comparative molecular modelling, which we applied in our work, does not provide a direct insight into the molecule dynamics but allows accurate measurements of theoretical distances between atoms. The in silico results suggest that mouse IgG3 has a uniquely extended span of Fab arms. We hypothesize that this feature of IgG3 accounts for its agglutination capability, and this hypothesis is supported by two experimental observations. First, all A- or B-specific antibodies that have been reported as suitable for serological diagnostics are of the large-span IgM class 30, 31, 32 ; second, A- or B antigen-specific IgGs of an isotype other than IgG3 cannot agglutinate RBCs 33, 34 . In summary, mouse IgG3 considerably differs from other IgG subtypes, especially in the extended length of the upper hinge. This characteristic may result in an unusually large range of its Fab arms and allow for the agglutination of RBCs.

Proteolytic truncation of IgM heavy chain occurs extracellularly and depends on serum proteases

The co-expression of two IgM heavy chain isoforms, full-length (μ) and truncated (μ′), was observed several years ago 35, 36 . The isoforms were detected in both human and mouse serum, as well as in supernatants from cell lines derived from these species. The truncated chain lacks a variable domain 35, 36 . Previous studies have shown that the two isoforms are produced by translation of alternatively spliced transcripts of a single μ chain gene 35 . Here, we demonstrate that the μ′ chain can also be produced by proteolytic trimming of a full-length heavy chain. Thus, we provide evidence that IgMs may be subjected to posttranslational proteolytic processing that occurs extracellularly and is catalysed by an unidentified serum protease(s). We showed that these enzymes are present both in mouse and bovine serum. We are currently investigating the specificity of this putative enzyme(s), which may facilitate its identification.

Our findings have several important implications. IgMs are produced early during the adaptive immune response and can induce strong cytotoxic effects after binding to a cell-associated antigen. According to our results, a protease present in mouse serum cleaves off a variable fragment of the IgM heavy chain. The loss of this variable domains leads to reduced avidity and to the generation of trimmed molecules, the physiological roles of which are undetermined.

There are three Ig receptors that can bind IgMs: one that is exclusively IgM-specific (FcμR) 37 and two that are IgM- and IgA-specific (pIgR and Fcα/μR) 38 . IgM binding to these receptors is independent of the antibody variable fragment 37, 39 ; thus, we speculate the following: ( i ) IgM transport across the epithelium should not be impaired by the truncated heavy chain, but trimmed molecules may provide inefficient immune protection; ( ii ) uptake of IgM-coated antigens by follicular dendritic cells and B-cells expressing Fcα/μR 38 might be blocked by truncated IgMs; and ( iii ) the functions of FcμR-expressing B- and T-cells, as well as NK lymphocytes 38, 40, may also be modified by the trimmed IgM variants. Moreover, truncated IgMs likely have a reduced ability to activate complement. Our results suggest that the physiological functions of IgMs may be attenuated due to N-terminal trimming by serum proteases.

IgM aggregation and μ heavy chain truncation lead to a rapid decrease in IgM activity

Research in the field of immunoglobulin structure, stability and formulation has been carried out for many years, and a vast amount of information concerning IgGs is available in the literature [reviewed by Wang et al . 26 ]. In contrast to IgGs, factors and processes that influence the stability of IgMs are much less understood. Studies on IgM stability and formulations are important to pharmaceutical science because, due to their potent complement activation capabilities, IgMs are among the candidates for next generation antibody therapeutics 41 . In comparison to IgGs, IgMs are much less stable, and their production is demanding and inefficient 27, 41 . Although the sensitivity of IgMs to elevated temperature and freezing is widely known, the exact molecular mechanism behind IgM instability is still not understood. In the present work, we used the accelerated storage test to investigate changes in the activity of IgM-based monoclonal reagents for blood typing. The analysed IgMs rapidly lost agglutination capability at 42 °C, an effect that was correlated with their aggregation and trimming of their heavy chains. Our results indicate that the observed aggregation is a dominant process that causes the loss of activity. According to western blotting analyses performed on samples that were resolved under reducing and non-reducing conditions, the aggregation seems to be primarily disulphide-based. However, significant levels of non-reducible aggregates were observed in IgM samples that were stored at 42 °C. The formation and exchange of disulphide bonds is the most common pathway that leads to IgG aggregation during storage 26 . We also report a specific and proteolytic trimming of the IgM heavy chain. The observed truncation occurred extracellularly and increased with time. We cannot determine how important the heavy chain truncation is for the IgM stability based on these results. We would like to emphasize that the activity of IgM-based reagents after 6 days of storage at 42 °C was significantly reduced or almost completely lost, despite there being a large amount of full-length heavy chain in the reagent. The attempts to prevent the trimming using protease inhibitors unexpectedly resulted in the promotion of aggregate formation, an effect that was likely induced by one or several active components of the inhibitor cocktail. Moreover, we hypothesize that the inhibition of heavy chain trimming itself may induce IgM aggregation by a currently unknown mechanism. One group has reported a decrease in the molecular mass of two mouse IgMs (from approximately 950 kDa to approximately 600–800 kDa) during storage in PBS over 180 days at 37 °C; this effect was accompanied by progressing aggregation. The aggregation and fragmentation were both clearly inhibited by lowering the pH to 5.5 and the addition of 20% sorbitol 28 . When all heavy chains in a pentameric IgM molecule were trimmed to 55 kDa polypeptides, the molecular mass of the whole oligomer decreased from 970 kDa to approximately 800 kDa, which is in the mass range reported in the cited work. Thus, it seems possible that the authors observed the heavy chain trimming catalysed by residual serum proteases. This trimming seems to be an initial step of IgM fragmentation and is followed by further proteolysis events, the loss of the light chain, and deglycosylation, resulting in a lowering of the IgM molecular mass to 600 kDa.

DSC analyses revealed that the Fab of M18 (IgG3) has a high T m, falling between 70 °C and 80 °C, which is the range for IgGs reported by other investigators 42 . The DSC thermogram of O10 (IgM) consisted of two transitions, the first of which likely originates from the Fab. Mueller et al . 28 presented thermograms of eight different IgMs and, similar to our data, the highest peak (T m between 63–68 °C at pH 7.5) appeared at the beginning of the thermal unfolding for each IgM 28 .

Comparison of the thermograms for IgGs and IgMs indicates that the denaturation of the Fab in IgM occurs at a lower temperature than for IgG. This effect may reflect differences in the stability of IgGs and IgMs that are stored at elevated temperatures. An unfolding event occurring at the lowest temperature during DSC scan is often considered as an indicator of the overall protein stability 43 . The first peak observed in IgG thermograms reflects the CH2 domain 29 . Although the CH2 unfolding has a lower T m than the putative transition of the IgM Fab, it is reversible; thus, it should not affect the overall stability of the IgG 42 .

The influence of heating at 42 °C was noticeable in the case of O10 samples that were subjected to DSC experiments. The total ΔH cal did not change after pre-treatment of O10 at elevated temperature. This result indicates that none of the domains of O10 stored at 42 °C for five days underwent significant unfolding. However, thermograms obtained for the control and preheated O10 samples differed in the relative contribution of to the total ΔH cal . We believe that this change reflects slight structural and/or chemical alterations that occurred during the accelerated storage of O10. The results that were obtained for MM30 suggest that the truncated heavy chain may influence the thermal unfolding of IgM, thus affecting the stability of the antibody during storage. To test this hypothesis, mutated IgMs that are resistant to truncation should be generated and their DSC profiles compared with those of parental proteins.

Mouse IgG3s could replace IgMs in haemagglutination assays

Mus IgG3 kan vara mer genomförbara och intressanta alternativ till IgM, som för närvarande används i serologisk bestämning av blodgrupper. IgM: er har två stora nackdelar genom att ( i ) de är instabila, känsliga för värme och frysning; och ( ii ) deras produktion och rening är vanligtvis ineffektiv och krävande 27, 41 . Som vi har visat har M18 IgG3 en agglutineringspotential som liknar IgM men är med fördel hållbar och effektivt producerad. Agglutinerande IgG3s verkar vara extremt sällsynta. Vi kunde bara hitta tre rapporter om sådana antikroppar. En av dessa, 2H12, känner igen glykoforin A 44 . I detta fall orsakade inte IgG3: s förmåga att agglutinera mycket överraskning eftersom glykoforin A sticker ut signifikant från erytrocytglykokalxen; avståndet mellan två epitoper på två celler är således mycket mindre än avståndet mellan cellytor. Ett annat exempel är IgG3-klon 6.1.5, rapporterad 1984 34 som kan agglutinering av både A- och B-grupp RBC. Emellertid översattes denna upptäckt inte till en diagnostisk applikation på grund av antikroppens breda specificitet. Den tredje rapporten, av Blanchard et al . 45 avsåg tre IgG3: NaM-1C9 (anti-A), NaM-1F6 (anti-A) och NaM-2E11 (anti-B). Dessa IgG3s uppvisade låg hemagglutineringspotential, vilket gjorde dem lämpliga för flödescytometri-analys av RBC: er 45 .

I motsats till de tidigare rapporterade IgG3-antikropparna med liknande specificitet är M18 en absolut specifik IgG3-antikropp som uppvisar en hemagglutineringspotential som liknar IgMs. Således kan M18 användas vid rutinmässig blodtypning baserat på direkt hemagglutinationstest.

På grundval av våra resultat antar vi att förmågan hos mus-IgG3 att agglutinera är en inre egenskap hos denna molekyl som är resultatet av dess unika struktur och inte beror på epitoplokalisering. Även om detaljerade studier om M18-struktur-funktion-relation kan ge en djupare inblick i IgG3-biokemi från mus, är giltigheten för denna hypotese fortfarande en öppen fråga. Genereringen av en genetiskt konstruerad mus-IgG3 med variabla domäner som härrör från en antikropp som känner igen antigen D från Rh-blodgruppssystemet kan ge svaret. Eftersom D-antigenet är lokaliserat mycket nära RBC-plasmamembranet 46, skulle erhållande av anti-D-agglutinerande IgG3 ge idealiskt bevis för vår hypotes om att IgG3-mus kan ersätta alla ömtåliga IgM i direkt agglutineringsanalyser.

Sammantaget jämfördes de agglutinerande M18-antikroppsformuleringarna M18 med fördel med IgM-baserade reagens och med tanke på dess huvudsakliga fördelar med avseende på stabilitet och produktivitet verkar denna antikropp vara väl lämpad för diagnostiska tillämpningar.

Material och metoder

RBC och agglutination

Bevarade standardmänskliga RBC och prover av ny donerat blod var vänliga gåvor från Regional Center of Blood Donation and Blood Treatment i Katowice, Polen. Alla blodprover testade negativa med avseende på virala och bakteriella patogener. Agglutinationstester, inklusive indirekta agglutinationstester, utfördes med användning av glid- eller rörtekniken enligt de nuvarande riktlinjerna från Världshälsoorganisationen 16, om inte annat anges. Agglutination utvärderades med användning av en sexpunktsskala, som sträckte sig från 4+, vilket återspeglade fullständig agglutination, genom 3+, 2+, 1+, +/− och en negativ poäng. Betyget '1+' motsvarar svagt positiv agglutination synlig med det blotta ögat. Antikroppstitrering utfördes med användning av ett direkt agglutinationstest med serie tvåfaldiga utspädningar av antikroppsberedningen. Titern var den högsta utspädningen som inducerade en 1+ agglutineringspoäng.

Musimmunisering och hybridomgenerering

Nio veckor gamla Balb / c-möss, erhållna från Mossakowski Medical Research Center, Polish Academy of Sciences, Warszawa, immuniserades intraperitonealt med 2 × 10 7 tvättade RBC: er suspenderade i 150 ul PBS. Cellerna injicerades varje månad och minst 4 injektioner gavs. Tre dagar, två dagar och en dag före fusionen fick mössen en booster av en ytterligare injektion av RBC: er. Hybridomen genererades med användning av protokollet av Page och Thorpe 47 . Musmyelomcellinjen Sp2 / 0 användes som en fusionspartner. Media som samlats in från brunnarna med växande hybridomkloner screenades för antikroppsproduktion med användning av glidagglutinationstestet. Cellerna som producerade antikroppar som specifikt och exklusivt kände igen antigen B från ABO-blodgruppssystemet förökades och subklonades ytterligare med användning av den begränsade utspädningstekniken för att säkerställa monoklonalitet. Alla djurförsöken genomfördes i enlighet med standardriktlinjerna av National Ethics Committee for Animal Experimentation. Riktlinjerna uppfyllde de etiska standarderna som krävs enligt polsk lag (Animal Research Act, 2005) och i EU-direktiv 2010/63 / EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Alla procedurer som involverade möss godkändes av Animal Experimental I Local Ethics Committee, Kraków (godkännande nr 71/2009) och alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande.

Cellkulturer och bioreaktorer

Hybridom- och HEK293-celler odlades i DMEM med 4, 5 g / 1 glukos (Lonza) och 5% FBS (Biowest) vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubator. För att producera en formulering av antikroppar vid en hög titer lämplig för diagnostik anpassades hybridomcellerna till BD Cell Mab Medium Quantum Yield medium (BD Bioscience) och odlades i tvåkomponents engångs CELLine1000 bioreaktorer (BD Bioscience). Alla cellkulturer screenades rutinmässigt för Mycoplasma spp . kontaminering med användning av PCR med rDNA-specifika GPO1- och MGSO-primrar 48 .

Analys av nukleotidsekvenser av V-regioner

Gener som kodar för variabla regioner av antikroppar amplifierades såsom beskrivits av Wang et al . 49 och sekvensbestämdes med användning av termineringstekniken för dideoxy-kedja (Genomed, Polen). De erhållna sekvenserna analyserades med användning av IMGT / V-QUEST-programmet, version 3.3.5, tillhandahållet av International Immunogenetics Information System 50, 51 .

Isotypomkoppling

cDNA: er som kodar V-fragmenten från de tunga och lätta kedjorna infördes i pFUSEss-plasmider innehållande sekvenser som kodade för den konstanta regionen av mus-yl-, y3- eller k-kedjan (Invivogen). V-fragmentet i en tung kedja klonades in i pFUSEss-CHIg-mGl- och pFUSEss-CHIg-mG3-vektorer med användning av EcoRI och AfeI-restriktionsställen. På liknande sätt infördes V-fragmentet i en lätt kedja i pFUSE2ss-CLIg-mK-plasmid med användning av EcoRI och Bst API. Alla de genererade konstruktionerna verifierades genom sekvensering (Genomed, Polen). Isotypvarianterna uttrycktes transient i HEK293-celler som transfekterades med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Jämförande molekylär modellering

Jämförande molekylär modellering av immunglobuliner utfördes på I-TASSER-servern 52 enligt protokollet tillhandahållet av författarna 53 . Modeller med högsta C-poäng, vilket indikerar ett högt förtroende för förutspådda modeller, visualiserades och analyserades med PyMOL Molecular Graphics System, version 1.3 (Schrödinger).

Antigen dockning

M18-antikroppsstrukturen erhållen med användning av jämförande molekylär modellering simulerades i GROMACS 4.6.5 54, 55 under 10 n med ett CHARMM36-kraftfält under förhållanden liknande de som publicerades av Rahimi et al . 56 Strukturen för antigenet, blodgrupp B-trisackarid, erhölls från PubChem, molekyl ID: 10206531, och parametriserades för CHARMM36 med användning av CGenFF 3.01 automatiserad topologibyggare 57, 58 . Sedan dockades B-trisackarid i M18-modellen med hjälp av Autodock Vina 59 . Strukturen för antikroppen komplex med det dockade antigenet med den lägsta bindande energin simulerades ytterligare under 500 ps med samma parametrar som tidigare. Rörelser inom systemet begränsades av en harmonisk kraft på 10000 kJ × mol −1 × nm −1 mellan proteinet och B-trisackariden, och positionskontroller sattes på kolatomer i fukosringen.

Antikroppsrening

CaptureSelect LC-kappa (mur) Affinity Matrix och CaptureSelect IgM Affinity Matrix (båda från Thermo Fisher Scientific) användes för rening av monoklonala IgG3- och IgM-antikroppar från mus. Reningen utfördes enligt tillverkarens instruktioner och följdes av dialys mot en buffert lämplig för ytterligare procedurer. Renheten av antikroppar utvärderades genom SDS-PAGE och silverfärgning av gelerna. Antikroppskoncentrationen bestämdes med användning av en BCA-analys 60 med bovin y-globulinfraktion (Pierce) som referens.

Fragmentering av IgG3 till F (ab ') 2

Pepsin-matsmältning av mus-IgG3 utfördes väsentligen såsom beskrivits av Andrew 61 . Spjälkningstiden optimerades experimentellt till 30 minuter. För att separera F (ab ') 2- fragment från kvarvarande antikroppar i full längd laddades reaktionsblandningen dialyserad mot PBS pH 8, 0 på protein A-kromatografikolonn (Pierce), och den obundna fraktionen innehållande F (ab') 2 uppsamlades.

ELISA

En standardsmörgås ELISA 62 användes för mätning av antikroppskoncentration. Mus-IgM B-cell ELISpot utvecklingsmodul (FoU-system) och en standard av mus-IgM (klon MM30, Abcam) användes för kvantifiering av IgM. Koncentrationen av IgG3 i mussera bestämdes med användning av get-polyklonal infångningsantikropp specifikt gentemot mus-IgG3 (Sigma) och en biotinylerad get-anti-mus kappa polyklonal detekteringsantikropp (AbD Serotec). Bundna biotinylerade antikroppar detekterades med HRP-konjugerat streptavidin (FoU-system). Koncentrationerna av IgG3 och IgG1 i cellkulturmedium efter övergående uttryck utvärderades med användning av en get-polyklonal infångningsantikropp som känner igen mus-kappakedjan (AbD Serotec), en monoklonal kanin-anti-mus-IgG1 / IgG3-detekteringsantikropp (klon M111-2, Abcam ) och en HRP-konjugerad get-anti-kanin polyklonal antikropp. Renad mus IgG3 (klon M18) och IgG1 (klon MCP21, Sigma) användes som standarder. Ett kolorimetriskt substrat för HRP OptEIA (BD Bioscience) användes i alla experiment. Absorbansen avlästes med en Molecular Devices Versa Max (Sunnyvale, USA) mikroplatta spektrofotometer, och koncentrationerna beräknades med användning av SoftMax Pro-mjukvara.

EC 50- beräkning

EC50 bestämdes med användning av ELISA på RBC av B-typ, som immobiliserades på ELISA-plattorna såsom beskrivits av Bigbee et al . 63 . Endogent RBC-peroxidas blockerades med 3% H202 under 20 minuter. De immobiliserade RBC: erna inkuberades under 2 timmar med tvåfaldiga serieutspädningar av HEK293-odlingsmedium innehållande övergående uttryckta M18_IgG3- och O10_IgG3-antikroppar. Antikroppskoncentrationerna i media bestämdes med användning av en IgG3-specifik ELISA. Mängderna av antikroppar bundna till RBC detekterades med biotinylerad get-anti-mus kappa polyklonala antikroppar (1: 3000, AbD Serotec), HRP-konjugerad streptavidin (1: 40000, Sigma) och ett kolorimetriskt substrat för HRP OptEIA (BD Bioscience). De erhållna absorbansvärdena planerades mot koncentrationer av antikropparna med användning av ett online-verktyg (www.ic50.tk), som också användes för EC50-beräkningarna.

Accelererade lagringsstudier

Renade antikroppar i PBS eller filtrerade cellodlingsmedier justerade till pH 7, 5 med 20 mM Tris-HCl kompletterades med 0, 01% tiomersal (Sigma), ett konserveringsmedel som vanligtvis används för antikroppsformuleringar. M18, O10 och Q6-antikroppar renades internt som beskrivits ovan. MM30 köptes från Abcam. Medierna som samlats in från kulturer av O10, Q6, A19, A2 och 2E11-kloner användes i experimenten. De interna genererade klonerna A19 och A2 producerar IgM som specifikt agglutinerar RBC: er av blodgrupp A, medan den interna genererade klonen 2E11 producerar IgM-specifik mot ett mikrobiellt antigen. Proverna lagrades vid 42 ° C och 4 ° C under de angivna tidsperioderna. I vissa experiment sattes proteasinhibitorcocktails (Sigma och Thermo Fisher Scientific) och 5 mM fenantrolin (Bioshop) eller lämpliga volymer av deras lösningsmedel (DMSO och metanol) till odlingsmediet. Efter lagringsförsöken analyserades proverna med användning av DSC eller SDS-PAGE följt av western blotting.

SDS-PAGE och western blotting

SDS-PAGE utförs enligt standardprotokollet 64 i 10% eller 6% geler för att reducera respektive icke-reducerande förhållanden. Proteinseparation följdes av en våt elektrotransfer på ett PVDF-membran (Millipore) 65 . Efter blockering med 3% skummjölk i PBS under 2 timmar inkuberades membranet under 1 timme med get-polyklonalt HRP-märkt anti-mus-IgM-kappa (AbD Serotec) eller get-polyklonalt HRP-märkt anti-mus-Ig (BD Pharmingen) detekteringsantikroppar. Banden visualiserades med användning av Immobilon Western Chemiluminescent substrat för HRP (Merck Millipore) och analyserades med en Fusion Fx-apparat med Fusion Capt Advance Fx5-programmet (Vilbert Lourmat, Frankrike).

Differential scanning calorimetry (DSC)

DSC-experimenten utfördes med användning av NANO DSC Series III System med platina kapillärcell (TA Instruments), med en aktiv volym av 0, 3 ml. För att undvika bubbelbildning under uppvärmningsläget avgasades proverna innan de laddades genom att dra ett vakuum av 30, 4–50, 7 kPa på lösningen under en period av 10–15 minuter. Provcellen fylldes sedan med 0, 3 ml provlösning och en lika stor buffertvolym användes som referens. Cellerna förseglades och termisk jämviktades i ungefär 10 minuter vid starttemperaturen. Alla mätningarna utfördes på prover under 0, 304 MPa-tryck. Uppgifterna samlades in i intervallet 5–95 ° C vid en uppvärmningsscanningshastighet på 1 ° C −1 . Termogram korrigerades genom subtraktion av buffertblankavläsningar och normaliserades till proteinkoncentrationen. Varje datamängd analyserades med avseende på termodynamiska parametrar med ett mjukvarupaket levererat av TA Instruments. Höga värden för skalningsfaktorn (Aw) tilläts i anpassningsalgoritmen.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Klaus, T. et al . Agglutinerande mus-IgG3 jämförs gynnsamt med IgM i typ av blodgrupp B-antigen: Funktionalitets- och stabilitetsstudier. Sci. Rep. 6, 30938; doi: 10.1038 / srep30938 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.