I aktiooptofysiologiska analyser avslöjar funktionell diversifiering av dopaminerga nervceller i nematoden c. elegans | vetenskapliga rapporter

I aktiooptofysiologiska analyser avslöjar funktionell diversifiering av dopaminerga nervceller i nematoden c. elegans | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Cellulär neurovetenskap
  • Avbildning och avkänning
  • neurofysiologi

Abstrakt

Många neuronala grupper, såsom dopaminfrisättande (dopaminerga) neuroner, är funktionellt divergerande, även om detaljerna i sådan divergens inte är väl förståda. Dopamin i nematoden Caenorhabditis elegans modulerar olika nervfunktioner och frigörs från fyra vänster-högerpar av nervceller. De terminala identiteterna på dessa dopaminerga nervceller regleras av samma genetiska program, och tidigare studier har antytt att de är funktionellt redundanta. I denna studie visar vi emellertid funktionell divergens inom de dopaminerge neuronerna från C. elegans . Eftersom dopaminergiska nervceller från djuren förmodligen aktiverades av mekanisk stimulans vid inträde i en gräsmatta av deras livsmedelsbakterier, utvecklade vi ett nytt integrerat mikroskopsystem som automatiskt kan spåra ett fritt rörligt ( i aktio ) C. elegans för att individuellt övervaka och stimulera de neuronala aktiviteterna hos flera neuroner. Vi fann att endast huvud-dorsalt par dopaminerga nervceller (CEPD), men inte huvud-ventrala eller bakre par, företrädesvis aktiverades vid matinträde. Dessutom uppvisade den optogenetiska aktiveringen av CEPD-neuroner enbart effekter liknande de som observerades vid matinträde. Således visade våra resultat funktionell divergens i genetiskt liknande dopaminerga nervceller, vilket kan ge en ny ingångspunkt för att förstå funktionell mångfald av neuroner utöver genetisk terminalidentifiering.

Introduktion

En mängd neuronala typer finns i ett djurhjärna, som var och en spelar specifika fysiologiska roller baserat på sin egen egenskap för integrativ hjärnfunktion. Neuronala celltyper utmärks främst på grundval av skillnader i genuttryck liksom anatomiska egenskaper såsom lokalisering, morfologi och internuronal anslutning. Dessa skillnader regleras av genetiska program såväl som temporära och positionella interaktioner 1, 2 .

Dopamin (DA) är en neurotransmitter som har undersökts intensivt på grund av dess framträdande roller i hjärnfunktioner hos högre djur. Det är ansvarigt för lokomotorisk reglering, kognition, känslor, belöning och lärande, och dess dysfunktion orsakar Parkinsons sjukdom, schizofreni och drogberoende 3 . Trots att de har så omfattande roller, är det intressant att cellkropparna i dopaminerga (DAergiska) neuroner är belägna i begränsade områden i hjärnan, såsom mellanhjärnan och hypothalamus 4 . Nyligen genomförda studier har avslöjat funktionell avvikelse från DAergiska nervceller, såsom skillnader i sensorisk information som de svarar på och deras responsmönster 5, 6, 7 . Icke desto mindre har de detaljerade egenskaperna och mekanismerna för sådan avvikelse inte klargjorts tillräckligt.

Likaså frigörs DA från ett begränsat antal neuroner och reglerar en mängd nervfunktioner, såsom rörelse, sensorisk uppfattning och inlärning i nematoden Caenorhabditis elegans 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 . Genom att utnyttja djurets fördelar, såsom dess lilla nervsystem som består av bara 302 nervceller, genomförbarhet av genetiska analyser och användbarheten av en serie cellspecifika promotorer 16, 17, har de reglerande mekanismerna för DA-signalering på dessa nervfunktioner studerats vid cellulära och molekylära nivåer. I hermafroditer (djurens främsta sexuella form) är fyra vänster-högerpar av neuroner DAergiska: CEPD (cefalisk sensilla-dorsal), CEPV (cefalisk sensilla-ventral), ADE (främre deirider) och PDE (posterior deirider) 18 (Fig. 1a; Observera att djuren vänster-högeraxel är vertikal och deras ryggventralaxel är horisontell när de rör sig i standardlaboratoriet). De terminala identiteterna för alla dessa DAergiska nervceller regleras tätt av samma cisreglerande element och samma transkriptionsfaktorer i C. elegans som hos däggdjur 19, 20 . Dessutom fungerar Dl- och D2-receptorer i flera typer av neuroner hos djuren 21, ett fenomen som är analogt med DA-signalering hos däggdjur.

Image

( a ) Ett schematiskt diagram över arrangemanget av de fyra DAergiska neuronparen. Observera att detta är en vy ovanifrån av ett djur på en agaryta. ( b ) Ett arrangemang av lappar av bakteriegräsmattor på en agaryta. Liknande experimentella tillstånd rapporterades nyligen av Hardaway et al . 38 . ( c ) Livsberoende avtagande respons från vildtyp och mutanta djur. Välmatade djur (svarta staplar) eller djur svält i 30 minuter (grå staplar) överfördes till den centrala positionen för analysplattan som visas i b och böjnumren bedömdes under 20 sekunder efter matinträdet. Antalet djur som används i varje tillstånd visas längst ner.

Bild i full storlek

Tidigare studier har antytt att DAergiska nervceller i C. elegans aktiveras av närvaron av deras livsmedelsbakterier, en av de mest inflytelserika miljöstimulerna som modulerar olika aspekter av deras beteende. Till exempel bromsas djurets rörelsehastighet vid inträde i en bakteriegräsmatta, som imiteras av en mekanisk stimulans från Sephadex-pärlor 8 . Detta långsamma svar medieras av DA-signalering, och laserablering av alla fyra par DAergiska nervceller var nödvändigt för att fullständigt undertrycka långsamheten, vilket antyder att neuronerna fungerar redundant 8 . Nyligen avslöjade användningen av en genetiskt kodad kalciumindikator 22 huvudet DAergiska CEP-par aktiverades genom mekanisk stimulering med en glasspets 12 . Dessutom orsakade optogenetisk stimulering 23, 24 av alla DAergiska nervceller 25 långsamhet. Det faktiska förhållandet mellan bakteriell närvaro och DAergisk neuronaktivitet är dock fortfarande oklart. Kan bakteriegräsmattan ge en tillräcklig mekanisk stimulans för att aktivera DAergiska nervceller? På vilket sätt (till exempel toniskt eller fasiskt) aktiveras DAergiska neuroner? Vilka DAergiska nervceller aktiveras verkligen genom matinmatning? Dessa frågor bör besvaras för att förstå hur livsmedelsnärvaro, den mest inflytelserika informationen för djuren, omvandlas till sensorisk nervaktivitet och sedan överförs till nedströms målsneuroner för att modulera flera beteendemässiga aspekter. Men metodiken för att studera detta förhållande har varit svår. För kalciumavbildning, eftersom bakteriell närvaro avkännes mekaniskt men inte kemiskt, är den allmänt använda mikrofluidiska flödeskanalen för djurets stimulering 26 inte tillämpbar. Även om autospårande mikroskopsystem för in vivo- kalciumavbildning eller optogenetisk stimulering av fritt rörliga C. elegans nyligen blev tillgängliga 27, 28, 29, 30, 31, 32, förblir separat analys av aktiviteterna för enskilda DAergiska neuroner utmanande eftersom 3 par av DAergiska nervceller (CEPD, CEPV och ADE) är alla belägna i huvudgängarna (Fig. 1a), och diskriminering av maskinsyn av dessa neuroner har varit svår, särskilt under spårning.

Här etablerade vi ett integrerat mikroskopsystem för kalciumavbildning och optogenetisk stimulering av individuella nervceller av fritt rörliga ( i aktio ) C. elegans med hög spatiotemporal upplösning. Medan de terminala identiteterna för alla DAergiska nervceller regleras tätt av samma genetiska program 19, 20 och dessa neuroner betraktas som funktionellt redundanta 8, hittade vi funktionell diversifiering bland DAergiska neuronpar i det långsamma svaret vid matinträde. I synnerhet aktiverades CEPD-neuronerna företrädesvis vid livsmedelsinträde jämfört med CEPV-neuronerna trots deras symmetri på den stora anatomiska nivån 33 (fig. La). De bakre PDE-neuronerna verkade inte vara aktiverade. Dessutom orsakade den optogenetiska aktiveringen av CEPD-nervceller, men inte av CEPV- eller PDE-nervceller, ett beteendemässigt svar som det som för livsmedelsinmatning. Således visar våra resultat funktionell diversifiering av genetiskt och till och med anatomiskt liknande DAergiska nervceller.

Resultat

Experimentell inställning för optofysiologisk analys under matinföring

Här fokuserade vi på bromsningen av rörelse vid inträdet av en matbakteriell gräsmatta 8, ett av de mest framstående DA-beroende beteendesponserna från C. elegans . Djuren minskar frekvensen av kroppens böjning och bromsar sin rörelse vid matinträde, vilket troligen beror på att djuren migrerar snabbare för att ta reda på mat när de är av mat, och de vandrar långsammare på mat för att konsumera det. För den optofysiologiska analysen av det långsamma svaret vid matinträde optimerade vi det experimentella tillståndet (Fig. 1b). Även med ett tunt lager (30-40 mikrometer) av bakteriegräsmatta som inte stör fluorescerande avbildning, reproducerades den matintrångsberoende bromsningsresponsen (Fig. 1c). Det långsamma svaret påverkades av mutationer i tyrosinhydroxylas- kat-2 eller TRPN-kanal trp-4 , vilka krävs för DA-biosyntes respektive DAergisk neuronaktivering, såsom tidigare rapporterats 8, 12 (fig. 1c, svarta staplar). Det långsamma svaret observerades i både cat-2 och trp-4- mutanter efter 30 minuters svält (fig. 1c, grå staplar), vilket är förenligt med det faktum att 30-minuters svältning orsakar ett förbättrat långsamhetsrespons som är beroende av serotonin och inte på dopamin 8 .

Cellinriktat kalciumavbildning och optogenetik för fritt rörliga djur

För att optofysiologiskt analysera flera DA-neuronpar i aktio utvecklade vi ett autospårande mikroskopsystem med sofistikerade bildbehandlings- och maskinstyrningstekniker (fig. 2 och kompletterande video S1). Det automatiska spårningssystemet håller huvudet på en fritt rörlig C. elegans i mitten av synfältet med hjälp av en strukturmatchning-matchande algoritm 34 .

Image

Inställningar för kalciumavbildning ( a ) och optogenetisk analys ( b ) visas. Det motoriserade steget styrs för att låsa fast en del av djurets kropp i mitten av utsiktsfältet. I ( a ) är blått ljus upplyst till hela vyfältet för att väcka GCaMP6f och mCherry i alla DAergiska neuroner. I ( b ) lyser grönt ljus för mCherry till det fria synfältet för att övervaka positionerna för alla DAergiska nervceller, och blått ljus tänds för en av de DAergiska nervcellerna för att stimulera ChR2 vid behov. Positionen för den blåa ljusbelysningen uppdateras i realtid eftersom målneuronen rör sig i synfältet på grund av begränsningen av spårningsnoggrannheten. Ett IR-ljus användes för att skaffa ljusa fältbilder för mönstermatchning och spårning.

Bild i full storlek

I kalciumavbildningsuppsättningen användes bilderna av grön fluorescens från GCaMP6f 35 och röd fluorescens från mCherry 36 för att övervaka de intracellulära kalciumkoncentrationsförändringarna och cellkroppspositionerna för de multipla DAergiska nervcellerna. De individuella signalintensiteterna vid var och en av cellkropparna mättes separat off-line. Den konventionella metoden som spårar den ljusaste punkten i synfältet är dock inte tillämplig. Så här utvecklade vi en mjukvara som individuellt spårar flera lysrörssignaler med den optiska flödesmetoden (Supplementary Video S2). Det bör noteras att den uppmätta fluorescerande signalen från en cellkropp antagligen återspeglar summan av vertikalt inriktade ett par vänster- och högerneuroner.

I optogenetikuppsättningen används den optiska flödesmetoden on-line: channelrhodopsin-2 (ChR2), en ljusgrindad katjonskanal 23 och mCherry uttrycks tillsammans i de DAergiska nervcellerna och mCherry-signalerna användes för att identifiera positionerna av flera DAergiska neuronpar. Blått ljus tänds endast vid den omedelbara positionen för den riktade cellen med en högeffekt videoprojektor som en ljuskälla 37 (kompletterande video S3). Med den höga hastigheten i sitt spårningssystem möjliggör denna metod optogenetisk aktivering av en bland flera målceller i huvudgången hos de rörliga C. elegans (se Diskussion). Vi kallade detta O ptogenetic S- timulering som är associerat med Ca lcium-avbildning för att ha N- ematoder (OSaCaBeN eller OSB) -system.

Anatomiskt symmetriska CEPD- och CEPV-neuroner aktiveras asymmetriskt

Med hjälp av kalciumavbildningsuppsättningen mätte vi aktiviteterna för CEPD- och CEPV-nervcellerna, som är symmetriska i den dorso-ventrala axeln på den anatomiska nivån och utvidgar deras sensoriska ändar till den främre änden av kroppen 33 (fig. 1a). Vid matinträde, vilket sannolikt producerar en subtil mekanisk kraft, aktiverades CEPD- och CEPV-par som rapporterats nyligen 38, och aktiviteten upprätthölls åtminstone i 6 minuter (fig. 3a). Oväntat fann vi emellertid att CEPD-aktiveringen var gradvis och starkare, medan CEPV-aktiveringen var snabbare och svagare (Fig. 3a, c). Dessa resultat indikerar att CEPD- och CEPV-paraktiviteter vid livsmedelsinträde är asymmetriska, även om dessa neuronpar anses vara genetiskt oskiljbara och funktionellt redundanta. Vi analyserade också PDE-paret av DAergiska nervceller, vars processer täcker mer än hälften av kroppens bakre ände (fig. 1a). Matinmatningsberoende aktivering av PDE-par observerades endast i några få studier (Tabell 1, Fig. S1). ADE-neuronparet kunde inte analyseras på grund av svag GCaMP-fluorescens från cellerna, möjligen på grund av låg intracellulär kalciumkoncentration före och efter matinträde. Dessa resultat antyder att CEPD- och CEPV-neuronpar avkänner bakteriens närvaro vid matinträde, medan ADE- och PDE-neuronpar kan ägnas åt en annan roll. I trp-4- mutanter visade CEPD och CEPV litet svar vid inträdet av mat (Tabell 1, Fig. S1). Detta resultat överensstämmer med det faktum att CEP-neuroner hos trp-4- mutanten är defekta som svar på en viss typ av mekanisk stimulans: trp-4- mutanter svarade inte på mild och repetitiv pressstimul, utan svarade på en kontinuerlig press 12 .

Image

( a, b ) Svar från CEPD (överst) och CEPV (mitten) såväl som hastighet (botten) på välfodrade ( a ) eller svält ( b ) vilda typ av djur vid matinträde visas. Tiden när ett djur kom in i en bakteriegräsmatta bestämdes som t = 0. R / R0- värdena (medelvärde ± SEM) visas. Svaren från CEPD och CEPV övervakades från samma djur. Tjugonåtta och 11 djur analyserades med avseende på välmatade och svältade tillstånd. När det genomsnittliga R / R0- värdet var lägre än 1, 1 i både CEPD och CEPV hos ett djur, betraktades detta djur som "svarar inte", och dessa data utesluts. ( c ) Spridningsdiagram som jämför medelvärden av R / R0-värden mellan CEPD och CEPV för välmatade (vänster) eller svält (höger) vildtypsdjur vid matinträde). Ett två-tailed Mann-Whitney-test användes för den statistiska analysen.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Vi mätte vidare CEPD- och CEPV-paraktiviteter under utsultat skick. Svält är känt för att modulera olika aspekter av C. elegans beteende 16, 17, och DA-beroende beteendemoduleringar såsom områdesbegränsad sökning och kranhabituation är i allmänhet inte observerbara efter 30 minuters svält 10, 12 . Dessutom, efter svält, förbättras det långsamma svaret vid matinträde på ett serotoninberoende sätt 8 (fig. 1c). Oavsett var det inte klart om responsen från DAergiska neuroner själva moduleras av svält. Vi fann att svaren från CEPD och CEPV-nervceller på bakteriegräsmatta var väsentligen lika före och efter svält (fig. 3b, c), medan det långsamma svaret förbättrades (fig. 3a, b, botten). Dessa resultat antyder att svältinducerad modulering av DA-signalering inte kan inträffa i själva DAergiska nervceller utan snarare i målneuronerna, såsom sensoriska eller motoriska nervceller 12, 25, 39 .

CEPD är huvudsakligen ansvarig för matberoende långsammare beteende

Kalciumavbildning visade att CEPD- och CEPV-par aktiverades asymmetriskt vid matinträde. Förhållandet mellan denna asymmetriska aktivering och deras beteendekonsekvenser är dock fortfarande oklart. För att ytterligare belysa de funktionella skillnaderna i DAergiska neuronaktiviteter aktiverade vi de individuella DAergiska neuronparna optogentiskt och analyserade effekterna på det långsamma svaret. Vi etablerade transgena djur som uttrycker ChR2 och mCherry i alla DAergiska neuroner på liknande nivåer i cellerna (fig. 4a). Blå ljusbelysning för djurens hela kroppar orsakade en långsammare respons liknande den som observerades vid matinträde som tidigare rapporterats 25 (fig. 4b). Effekten observerades endast i närvaro av all-trans-retinal (ATR), som bör tillhandahållas som en co-faktor av ChR2 för djuren 40 . Vi tände sedan upp det blå ljuset till ett specifikt par av DAergiska nervceller med den optogenetiska installationen av OSB-systemet (Fig. 2b). När CEPD-paret specifikt aktiverades observerades ett signifikant avtagande svar, medan CEPV-aktivering inte orsakade någon signifikant avmattning (Fig. 4b). Vi testade också PDE-par men observerade inget svar. Dessa resultat indikerar att aktivering av CEPD-par oftast är ansvarig för det långsamma beteendet.

Image

( a ) Uttryck av mCherry och ChR2 :: GFP var på liknande nivåer mellan CEPD och CEPV men var lägre i ADE. ( b ) Jämförelse av effekterna av optogenetisk stimulering på långsamhet. När alla dopaminerga nervceller eller endast CEPD var upplysta, men inte CEPV eller PDE, inträffade signifikant långsammare. Ett Mann-Whitney-test användes för att jämföra de normaliserade rörelseshastigheterna före (-) och under (+) den blåa ljusbelysningen inom varje riktad celltyp, medan ett Kruskal-Wallis-test med ett post-hoc Steel-Dwass-test användes för att jämföra celltyper under belysning. Detaljer för de statistiska analyserna visas i kompletterande tabell S4.

Bild i full storlek

Diskussion

Här avslöjade vi den funktionella diversifieringen av DAergiska neuroner i C. elegans . För att analysera de fysiologiska egenskaperna hos DAergiska nervceller som aktiveras av den mekaniska stimulansen av bakteriell gräsmatta, etablerade vi ett integrerat mikroskopsystem för i aktiooptofysiologiska analyser och fann att CEPD- och CEPV-neuronpar, som har ansetts mycket likna varandra baserat på deras anatomiska symmetri och liknande genuttrycksmönster, är funktionellt asymmetriska när det gäller deras lyhördhet mot bakteriell gräsmattestimulus och effekten av deras aktivering på det långsamma svaret.

För att individuellt analysera de matinträdesberoende aktiveringsmönstren för DAergiska neuronpar av C. elegans , som är belägna i närheten och inte kan separeras med kända cellspecifika promotorer, etablerade vi OSB-systemet, som spårar fritt rörliga djur med höga spatiotemporal upplösningar och utför kalciumavbildning och optogenetisk belysning av enskilda neuronpar. Optogenetisk belysning kräver högre specifikationer än kalciumavbildning. För kalciumavbildning kan flera neuronala aktiviteter fångas samtidigt under spårning och analyseras individuellt efteråt ( dvs. off-line): enskilda neuroner kräver inte separat identifiering under spårning. Däremot, för optogenetisk belysning, bör enskilda nervceller identifieras under spårning ( dvs. online). För temporär upplösning spårar de allmänt använda optogenetiska mikroskopsystemen för att flytta C. elegans ett djur med en cykelhastighet av 25–50 Hz 29, 30, medan vårt system gör detsamma vid 200 Hz. Om ett system har en rumslig upplösning på 2-3 μm (den normala diametern på djurets neuronella cellkropp 41 ), bör ett djur som rör sig vid 150 μm / s spåras vid> 50 Hz (för detaljer, se Stirman et al . 30) ). För rumsliga upplösningar använder de nämnda två systemen en objektivlinsa på 4–10 × för att fånga upp bilden av djurets hela kropp för att spåra 29, 30, medan vårt system använder en objektiv med 20 × eller högre objektiv eftersom det tillåter spårning av en del av djurets kropp genom att använda en höghastighetsmönster-matchande algoritm 34 . De två systemen har använts i många laboratorier för individuella optogenetiska analyser av flera nervceller och / eller muskler som är tillräckligt separerade, såsom de i mitten och bakre delarna eller på motsatta sidor av kroppen 29, 30, 42, 43, 44, men inte för flera neuroner i djurets hjärna. Medan det finns några andra system för kalciumavbildning eller optogenetisk analys av flera neuroner i djurens hjärna 27, 28, 31, 32, möjliggör vårt OSB-system både kalciumavbildning och optogenetisk analys och avslöjade den funktionella asymmetri av DAergiska neuronpar av rörliga C. elegans , som är separerade med bara 20–25 μm i hjärnan. Vårt system kan också användas för funktionell dissektion av andra nervceller som är genetiskt omöjliga att skilja och som ligger i närheten; det kan också användas med rumsligt och tillfälligt mer komplex mönster av optogenetiska belysningar för att avslöja dynamiska förhållanden mellan aktiviteter av flera neuroner i framtida experiment.

Vi fann att CEPD- och CEPV-nervcellerna båda är toniskt aktiverade. Sensoriska neuroner uppvisar i allmänhet fasiska, toniska eller fasiska toniska svar 45 . Fasiskt svar signalerar förändringar i stimulans över ett brett spektrum, vilket bidrar till att ett djur navigerar till exempel i en kemisk gradient. Det toniska svaret signalerar stimulansens närvaro / frånvaro och styrka över tid. Tonic signalering används för att ge positionsinformation om kroppsdelarna (propriosception) eller för biologiskt betydande kemikalier som CO 2 45 . Dessa funktioner för fasisk och tonic signalering gäller också i C. elegans . Sensoriska neuroner för kemotaxi eller termotaxis visar fasrespons 46, 47, 48, medan de för avkänning av O 2 visar toniska svar 49 . Som sådan är det rimligt att spekulera att C. elegans DAergiska nervceller aktiveras toniskt för att signalera informationen om matens närvaro, vilket modulerar olika aspekter av djurets beteende. I en tidigare studie uppvisade CEP-neuroner ett snabbt anpassande ( dvs fasiskt) svar på en mekanisk press med en glasprobe 50, vilket antydde att den tonicrespons som observerats i denna studie kan utlöses av ett subtilt och / eller fluktuerande mekaniskt tryck omkring av djurets rörelse på en bakterie gräsmatta. Ganska intressant är tonisk signalering av DA väl känd i primater och gnagare: Tonic DA-frigöring möjliggör en rad motoriska, kognitiva och motiverande processer, medan fasiska DA-frigöringssignaler belöningar och varningsstimulering 3 . Således kan rollen och mekanismen för tonic DA-signalering i moduleringen av olika aspekter av nervsystemet evolutionsbesparas från nematoder till däggdjur.

Vår analys avslöjade att CEPD- och CEPV-par är funktionellt asymmetriska. Inte bara var deras aktiveringsmönster olika, utan effekterna av deras optogenetiska aktivering skilde sig åt: I båda fallen spelade CEPD en mer betydande roll. I C. elegans finns det några föregångsexempel på de asymmetriska funktionerna hos anatomiskt symmetriska sensoriska neuroner, inklusive ASEL-ASER 48 och AWC ON -AWC OFF (ref. 51). Dessa funktionella asymmetrier är relaterade till en ökad repertoar av de sensoriska stimuli som varje sensorisk neuron kan reagera på. Detta är troligtvis för att antalet sensoriska neuroner är ganska begränsat hos djuren (endast ett par par sensoriska neuroner används för att upptäcka tiotals luktämnen, till exempel 17 ). Detta kan också vara fallet för CEP-neuronpar.

Den funktionella asymmetrin för CEP-neuronpar var oväntad eftersom de inte bara verkar vara anatomiskt symmetriska, men DA är känt för att fungera extrasynaptiskt mot motor 39 och sensoriska 12, 25 neuroner. Det faktum att optogenetisk CEPV-aktivering inte orsakade det långsamma svaret kan antyda att, åtminstone för den specifika beteendemoduleringen, DA-funktion medieras intrasynaptiskt. CEP-nervceller har 77 kända postsynaptiska målneuroner, varav 14 neuroner har synaptiska ingångar från både CEPD- och CEPV-nervceller ("DV" i tabell S1 enligt //wormwiring.hpc.einstein.yu.edu). De flesta av de återstående synaptiska anslutningarna kommer från endast en av CEP-neuroner ("singel" i tabell S1). Således kan de odelade synaptiska anslutningarna från CEPD spela en viktig roll i det långsamma svaret. Alternativt kan de olika mängderna av frisatt DA orsakad av liknande optogenetiska aktiveringar vara orsaken till det olika långsamma svaret mellan CEPD och CEPV-par; även i detta fall kommer DA som släpps av CEPV troligen att ha sin egen roll.

Vi fann också att ett annat DAergiskt neuronpar, PDE: erna, inte aktiverades vid matintrång och orsakade inte långsamhet med optogenetisk aktivering. Även om alla DA-par betraktas som funktionellt redundanta, påverkade laserablering av CEP, men inte ADE eller PDE, signifikant det långsamma svaret 8 . På liknande sätt har CEP: er, men inte ADE eller PDE, nyligen rapporterats vara ansvariga för inlärning av matlappstorlek 52 . Dessutom har endast CEP-neuronpar sina sensoriska ändar vid kroppens främre ände (Fig. 1a). Sammantaget antyder dessa data att DA från CEPD spelar en viktig roll i det långsamma svaret, medan DA från andra DAergiska neuronpar har olika roller men fortfarande spelar en mindre roll i det långsamma svaret, eventuellt genom extrasynaptisk överföring. De andra paren kan aktiveras i en mycket längre tidsskala i närvaro av mat, med olika stimuli eller i olika sammanhang.

Så var kommer skillnaderna i DAergiska neuronpar här? Identiteten hos neuronala typer bestäms av uttrycket av typspecifika batterier av gener, såsom sådana för biosyntes av neurotransmittorer, jonkanaler, neurotransmitterreceptorer och signalmolekyler 2 . Sådan identitet av DAergiska nervceller regleras tätt av tre typer av transkriptionsfaktorer i C. elegans , liksom hos däggdjur 19, 20 . Ändå är CEP-par funktionellt asymmetriska och har olika synaptiska partners. Således föreslår våra resultat att det finns ännu okända mekanismer som ytterligare kan bestämma skillnaderna i samma neurontyp utöver genetisk terminalidentifiering.

metoder

stammar

Teknikerna som användes för att odla och hantera C. elegans var väsentligen såsom beskrivits tidigare 53 . C. elegans vildtyps Bristol-stam (N2) och de mutanta stammarna CB1112 cat-2 (e1112) , TQ1101 lite-1 (xu7) och TQ296 trp-4 (sy695) erhölls från Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, USA). Unga vuxna hermafroditer användes i alla beteendeexperiment.

Beteendeanalys för böjningsnummer

För livsmedelsplåstret odlades OP50-bakterierna i 100 ml LB-kultur över natten, snurrades ner och suspenderades i 10 volymer av nematodtillväxtmedium (NGM) buffert, och 5 mikroliter av suspensionen applicerades på fyra fläckar 5 mm från mitt på NGM-plattans yta (fig. 1b); denna bakteriegräsmatta var 30-40 mikrometer tjock och hindrade inte den lysrörsavbildningen. Fem unga vuxna maskar tvättades kort med 10 mikroliter NGM-buffert och placerades på 1, 7% agar-NGM-plattor med matlappar. Maskarna rörde sig fritt och kom spontant in i maten under videoinspelning med en dissektionsmikroskopi SZX10 och ett digitalkamerasystem DP72 (Olympus). De erhållna bilderna analyserades manuellt för att kvantifiera böjningsnummer såsom beskrivits tidigare 8 .

Molekylärbiologi och kärntransformation

För det DAergiska neuronspecifika uttrycket smältes mCherry 36, GCaMP6f 35 och kodonoptimerade ChR2 (H134R) 54 cDNA med dat-1- promotor 55 med ett GATEWAY-system ® (Thermo Fisher Scientific). ChR2 såväl som mCherry uttrycktes i lite-1 (xu7) mutantbakgrund för att reducera djurets svar på starkt blått ljus 56 . Germline-transformation utfördes med användning av mikroinjektion 57 . Flera transgena linjer användes för varje experimenttyp och de olika linjerna gav liknande resultat. Plasmiderna och de transgena linjerna som användes i denna studie listas i tilläggstabellerna S2 respektive S3.

Konfokal avbildning

Djuren bedövades med 5 mM natriumazid på en 2% agaros-NGM-dyna och täcktes med ett täckglas (Matsunami). Bilder av djuren som uttrycker dat-1 p :: mCherry och dat-1 p :: ChR2 :: GFP fångades med ett konfokalt mikroskop LSM710 (Carl Zeiss) med en Plan Apochromat 40 × 0, 95 NA-objektiv. Bilderna behandlades med Zen-programvara (Carl Zeiss).

Beteende spårning

Ett djur på en NGM-platta med matlappar placerades på ett motoriserat scen HV-STU-03W (HawkVision Inc., Fujisawa, Japan) kombinerat med ett BX51WI upprätt mikroskop (Olympus). Djuret belystes med infrarött ljus (IR) från en halogenlampa utan ett IR-skuren filter genom ett 32BP775 bandpassfilter (Olympus), och den ljusa fältbilden reflekterades med en DF670 dikroisk spegel (Semrock, USA) styrd till en GRAS-03K2M-C CCD-kamera (Point Grey Research, Kanada) med en 0, 35 × U-TV0, 35XC-2 TV-adapter för C-montering (Olympus). Bilderna togs vid 200 Hz av kameran och behandlades av ett skräddarsytt program för realtidsmönstermatchning på en Linux-dator (Intel Core i7-870) som reglerade det motoriserade scenen för att upprätthålla intressesregionen (ROI) för ett fritt rörligt djur i mitten av mikroskopets synfält 34 . I de flesta ramarna sattes en ROI runt huvudgängen. För PDE-avbildning inställdes ROI runt fluorescensen av PDE-cellkroppen. Varje djurs hastighet beräknades utifrån förflyttningar av autospårningssteget och ROI-positionen i synfältet.

Kalciumavbildning

Provet exponerades för vitt excitationsljus från ett Multi-oberoende Light Stimulation System (MiLSS; Aska Company, Hyogo, Japan) 37 genom ett BP460-495 bandpassfilter (Olympus) och en DM505HQ dikroisk spegel (Olympus). Fluorescensen infördes i ett W-View-optiksystem (Hamamatsu, Japan) innehållande två dikroiska speglar (545SP och 545LP) och bandpassfilter (D520 / 20m och 620DF35 för GCaMP respektive mCherry) genom en 20 × UPLFLN objektivlinsa (Olympus ). GCaMP- och mCherry-bilderna delades upp med W-View och fångades samtidigt sida vid sida på en EM-CCD-kamera ImagEM (Hamamatsu). Bilder togs vid en exponeringstid på 32, 6 ms och ett samplingsintervall på 100 ms med 2 x 2 binning. Kalciumavbildningssystemet triggades av en TTL-signal från det automatiska spårningssystemet och båda delsystemen kördes oberoende därefter i den nuvarande installationen. Bilderna sparades som okomprimerade 16-bitars TIFF-filer, cellkropparna spårades oberoende med ett skräddarsytt off-line optiskt flödesspårningsprogram, och signalintensiteter för särskilda regioner mättes med ImageJ (NIH). Bakgrundens signalintensitet subtraherades från cellkroppens. Denna process utfördes för fluorescerande bilder från både gröna (GCaMP) och röda (mCherry) kanaler i W-View, och förhållandet mellan fluorescerande intensiteter av GCaMP över mCherry ( R ) beräknades för att avbryta fluorescerande förändringar orsakade av rörelseartefakter. Medianförhållandet under 90 sekunder innan livsmedelsinmatningen definierades som baslinjen R0 , och det normaliserade förhållandet ( R / R0 ) beräknades sedan och analyserades ytterligare.

Optogenetiska experiment

Djuren odlades i närvaro eller frånvaro av ATR såsom beskrivits tidigare 58 och överfördes till en NGM-platta på OSB-systemet och hölls under 20 x objektivlinsen genom autospårning. Provet belyses med gröna och blå lampor med MiLSS genom ett XF3069 multibandspassfilter (Omega) och en FF493 / 574-Di01 dikroisk spegel (Semrock). Det gröna ljuset (540–570 nm; ~ 0, 4 mW / mm 2 ) belystes till det fria synfältet för realtidsoptiskt flödesspårning av de mCherry-uttryckande DAergiska neuronpositionerna. De fluorescerande bilderna av mCherry fångades genom bandpassfiltret 620DF35. Varje DAergisk neuron identifierades baserat på vulva-position från de ljusa fältbilderna, och en valdes manuellt och riktades sedan automatiskt av den optiska flödesspårningen. Efter 1 minut för mätning av basal rörelsehastighet och när masken rörde sig framåt överlappades blått ljus (450–470 nm; ~ 12 mW / mm 2 ) under 10 s till det fria utsiktsfältet eller vid positionen för den riktade cellkroppen, som uppdaterades vid 31, 7 Hz; eftersom det motoriserade steget justerade läget för djurets hjärna vid 200 Hz var den relativa neuronhastigheten tillräckligt långsam för encellsinriktning vid 31, 7 Hz. En rörelseshastighet på 10 s före och under stimulering beräknades enligt djurens beteendespårning och normaliserades med ensemblets median med en genomsnittlig rörelseshastighet före stimulering för varje riktad celltyp. Ett djur testades endast en gång för ljusstimulering för att undvika några hysteretiska effekter.

För att verifiera den spatiotemporala noggrannheten för vår cellinriktad ljusstimulering, upplyste vi först hela vyfältet med grönt ljus vid ~ 0, 4 mW / mm 2 för att visualisera alla de mCherry-uttryckande neuronala cellkropparna och riktade sedan en av cellkropparna med grönt ljus vid ~ 2, 6 mW / mm 2 för att ytterligare excitera mCherry-fluorescensen endast på den cellen. Resultaten (Video S3) visar att det riktade ljuset upplyste målcellkroppen men inte andra.

Dataanalys och statistik

Uppgifterna erhölls under 3 dagar från 10–40 djur för varje tillstånd i de flesta fall. Vi valde detta provnummer eftersom en storskalig beteendeanalys av C. elegans drog slutsatsen att en viss statistisk skillnad kan detekteras hos 10 djur, och 24 ± 14 (genomsnitt ± SD) djur per tillstånd användes 59 . Efter provtagningen uteslöts data från vissa djur för fig 3 och 4 när något av följande problem upptäcktes: (1) försök avbrutna av autospårningsfel, (2) otillräcklig mCherry eller basal GCaMP6f fluorescensintensitet för optiskt flöde spårning, eller (3) basal rörelsehastighet <0, 06 mm / s (medelhastighet ± SD hos normala djur var 0, 17 ± 0, 05 mm / s). När medelvärdet av R / R0 efter t = 0 var <1, 1 i ett djurs CEPD och CEPV, betraktades dessutom djuret som "inte svarar"; dessa data inkluderades inte i fig. 3 men visas i tabell 1.

Experimentella förhållanden, såsom närvaro / frånvaro av ATR, ljusstimulering eller olika stammar, randomiserades dagligen. Ett Kruskal-Wallis-test med ett post hoc Steel-Dwass-test användes för flera jämförelser i fig. 4b, medan ett Mann-Whitney-test användes för enstaka jämförelse i fig. 3c och 4b med användning av R (R-projektet) eller Prism ver. 5, 0 för Mac OSX (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Tanimoto, Y. et al . I aktio-optofysiologiska analyser avslöjar funktionell diversifiering av dopaminerga nervceller i nematoden C. elegans . Sci. Rep . 6, 26297; doi: 10.1038 / srep26297 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande video S1

  2. 2.

    Kompletterande video S2

  3. 3.

    Kompletterande video S3

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.